Tesis:
Insights into nitrogenase biosynthesis obtained from thermophilic prokaryotes
- Autor: PAYÁ TORMO, Lucía
- Título: Insights into nitrogenase biosynthesis obtained from thermophilic prokaryotes
- Fecha: 2020
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: http://oa.upm.es/66750/
- Director/a 1º: RUBIO HERRERO, Luis Manuel
- Director/a 2º: ECHAVARRI ERASUN, Carlos
- Resumen: Biological nitrogen fixation (BNF) is a high-energy cost enzymatic process that reductively breaks the triple bond of nitrogen gas (N2; N≡N) to render two ammonia (NH3) molecules. BNF is carried out, exclusively, by a few microorganisms belonging to the Bacteria and Archaea domains, known as diazotrophs. All diazotrophs fix N2 using a two-protein component nitrogenase enzyme. Based on its composition of metal cofactors, which are essential to activity, nitrogenases are classified as: molybdenum (Mo), vanadium (V) or iron-only (Fe) nitrogenases. All diazotrophs contain at least a Mo-nitrogenase, while some diazotrophs additionally contain V or Fe- nitrogenases. Therefore, the Mo-nitrogenase is the most abundant and is suggested to be the evolutionary predecessor of V- and Fe-nitrogenases. Mo-nitrogenase enzyme, as well as proteins required for its assembly, function, and regulation, are encoded in nitrogen fixation (nif) genes. The quantity and composition of a nif gene complement varies depending on the physiology and ecology of each diazotroph. However, a minimal set of six nif genes (nifHDKENB) has been established as essential criterium for being able to perform Mo-dependent N2 fixation. The present thesis investigates nitrogenase from the thermophilic bacterium Roseiflexus sp. RS-1, which appears depend only on nifHBDK. The NifH and NifDK nitrogenase structural components, and the biosynthetic protein NifB, have been characterized. Demonstration of in vitro activity present in purified Roseiflexus sp. nitrogenase components shows the existence of an alternative pathway for the biosynthesis of its active-site iron-molybdenum cofactor (FeMo-co). In Roseiflexus sp. FeMo-co biosynthesis seems to be NifEN-independent while NifDK has dual capability as FeMo-co maturase and nitrogenase enzyme. These results suggest that Roseiflexus sp. carries an enzyme complex likely resembling the predecessor of current Mo-nitrogenases before the events of duplication and divergence of nifDK and nifEN genes. Additionally, this thesis includes the first X-ray atomic structure resolution of a NifB protein. Because the Roseiflexus sp. NifB protein could not be crystallized, structure of the homologous NifB from Methanotrix thermoacetophila was solved in collaboration with the group of Dr. Yvain Nicolet at the Institute de Biologie Structurale. A novel [Fe4S4] cluster coordination involving two cysteine, one histidine and one glutamate residues was observed. NifB site directed mutagenesis and biochemical analyses performed as part of this thesis allowed us to refine a catalytic model for NifB-co synthesis, where a loop constituted by residues C62 to E65 has a central role in the orchestration of SAM binding/cleavage and [4Fe-4S] cluster stabilization. ----------RESUMEN---------- La fijación biológica de nitrógeno (FBN) es un proceso enzimático con un alto coste energético encargado de la rotura del triple enlace del nitrógeno molecular (N2; N≡N) para producir dos moléculas de amonio (NH3). La FBN es llevada a cabo exclusivamente por unos pocos microorganismos pertenecientes a los dominios Bacteria y Arquea, conocidos como diazotrofos. Todos los microorganismos diazotrofos fijan N2 empleando el complejo multienzimático nitrogenasa. En función de la composición de sus cofactores metálicos, esenciales para su actividad, las nitrogenasas se clasifican en: nitrogenasas de molibdeno (Mo), vanadio (V) o de hierro (Fe). Todos los diazotrofos contienen al menos la nitrogenasa de molibdeno, mientras que otros pueden contener adicionalmente las nitrogenasas de vanadio y/o hierro. Por lo tanto, la nitrogenasa de molibdeno es la más abundante y es propuesta como el predecesor evolutivo de las nitrogenasas alternativas de vanadio y hierro. Las nitrogenasas de molibdeno, así como el conjunto de proteínas requeridas para su ensamblaje, función y regulación, están codificadas por una serie de genes conocidos como nif (“nitrogen fixation genes”). La cantidad y composición de genes nif varía en función de las necesidades fisiológicas y ecológicas de cada diazotrofo. Sin embargo, se ha establecido un mínimo de seis genes nif como criterio esencial para la fijación de nitrógeno dependiente de molibdeno (nifHDKENB). En la presente tesis se investiga la nitrogenasa de la bacteria termófila Roseiflexus sp. RS-1, que parece depender exclusivamente de los cuatro genes nifHBDK. Los componentes estructurales de la nitrogenasa NifH y NifDK, así como el componente biosintético NifB, han sido caracterizados. La demostración de la actividad in vitro de los tres componentes Nif de Roseiflexus sp. RS-1 demuestra la existencia de una ruta alternativa en la biosíntesis del cofactor de hierro y molibdeno (FeMo-co). En Roseiflexus sp. la síntesis del cofactor FeMo-co parece ser independiente de NifEN, mientras que NifDK parece tener una capacidad dual, participando en la maduración de FeMo-co así como, manteniendo su actividad nitrogenasa. Estos resultados sugieren que Roseiflexus sp. posee un complejo enzimático que se asemeja al predecesor de las nitrogenasas de molibdeno actuales antes de los eventos de duplicación y divergencia de los genes nifDK y nifEN. Además, esta tesis incluye la primera descripción de la estructura de NifB obtenida por rayos X. Debido a que la proteína NifB de Roseiflexus sp. RS-1 no pudo ser cristalizada, la estructura de su homólogo procedente de Methanotrix thermoacetophila fue finalmente resuelta en colaboración con el grupo del Dr Yvain Nicolet del “Institute de Biologie Structurale”. Se ha descrito una coordinación novedosa de uno de los cofactores [Fe4S4], constituida por dos cisteínas, una histidina y un ácido glutámico. La mutagénesis dirigida sobre residuos de NifB, así como los ensayos bioquímicos llevados a cabo en esta tesis permitieron refinar un modelo catalítico para la síntesis del precursor NifB-co, donde una región flexible delimitada por los residuos C62 y E65 tiene un papel central en la coordinación de la unión y catálisis de la molécula de SAM, y en la estabilización de los cofactores [Fe4S4].