Tesis:
Synthetic Biology efforts in engineering nitrogenase Fe protein biosynthesis in plastids
- Autor: ESEVERRI SABATÉ, Álvaro
- Título: Synthetic Biology efforts in engineering nitrogenase Fe protein biosynthesis in plastids
- Fecha: 2020
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: http://oa.upm.es/66730/
- Director/a 1º: CARO BERNAT, Elena
- Director/a 2º: RUBIO HERRERO, Luis Manuel
- Resumen: La biología sintética (SynBio), descrita como la aplicación de la ingeniería a la biología, tiene como objetivo desarrollar nuevos sistemas biológicos y modificar los existentes creando comportamientos predecibles. La generación de cultivos agrícolas capaces de llevar a cabo la fijación biológica de nitrógeno, presentando bajos requerimientos de aporte de nitrógeno, se considera un desafío que podría conducir a una nueva revolución agrícola. Un posible enfoque para la generación de estos cultivos se basa en la transferencia directa de genes bacterianos nif, necesarios para la biogénesis de la nitrogenasa, al genoma de la planta. Los cloroplastos (plastidios) de plantas superiores son considerados compartimentos subcelulares que podrían albergar una enzima nitrogenasa activa, ya que exhiben las propiedades necesarias para acomodar el ensamblaje y la función de esta (poder reductor y abundancia de ATP) a pesar de la presencia de oxígeno. La modificación del genoma plastidial es posible en varios cultivos agrícolas, sin embargo, en cultivos de cereales esta técnica no es efectiva, lo que impone la necesidad de utilizar estrategias basadas en la expresión de transgenes codificados en el genoma nuclear, cuyas proteínas son posteriormente importadas a los plastidios. En una primera parte, este trabajo presenta el uso de herramientas de biología sintética para optimizar la producción de la proteína de hierro de la nitrogenasa (NifH) en cloroplastos de Nicotiana benthamiana. Los genes de fijación de nitrógeno de Azotobacter vinelandii nifH, M, U y S se rediseñaron para aumentar la acumulación de sus proteínas en células de tabaco, y su importación al cloroplasto se optimizó mediante la búsqueda de péptidos de tránsito de longitud mínima que funcionaran correctamente para cada proteína Nif específica. La presencia de la proteína NifM, una supuesta peptidil-prolil cis-trans isomerasa, resultó ser necesaria para la obtención de proteína NifH soluble en el estroma de los cloroplastos. Es importante destacar que la proteína NifH purificada a partir de cloroplastos de tabaco fue activa en la reducción de acetileno a etileno, siempre que se co-expresara junto a NifU y NifS. En una segunda parte, esta tesis describe la traslación de los conocimientos generados en experimentos con tabaco para su replicación en arroz. El mismo conjunto de genes de A. vinelandii se rediseñó para aumentar la acumulación de sus proteínas en Oryza sativa y los péptidos de tránsito, previamente seleccionados por su rendimiento en tabaco, se probaron para determinar su eficacia en la importación de una proteína marcadora a plastidios de diferentes tejidos de arroz, concretamente, callos, hojas y raíces. Los resultados mostraron que los péptidos de tránsito de longitud mínima de A. thaliana seleccionados también fueron capaces de mediar la importación de las proteínas Nif a cloroplastos de hojas de arroz. NifM, similar a lo que se ha observado anteriormente en bacterias, levadura y tabaco, resultó ser necesaria para la solubilidad de NifH en arroz. Sin embargo, no pudimos obtener plantas transgénicas de arroz que acumularan proteínas Nif en cloroplastos y, por lo tanto, la actividad de la proteína de hierro en cereales sigue siendo una incógnita. En conjunto, esta tesis presenta una prueba de concepto de la idoneidad de los cloroplastos como orgánulos para albergar nitrogenasa, y un procedimiento de optimización para asegurar la expresión de cualquier transgen codificado en el núcleo dirigido a plastidios de N. benthamiana y O. sativa, centrándose en el diseño de versiones sintéticas de genes que confieren una mayor acumulación de proteína y caracterizando un conjunto de péptidos de tránsito que dirigen de manera eficiente sus proteínas transportadas mientras minimizan los aminoácidos remanentes en la proteína madura tras la importación. ----------ABSTRACT---------- Synthetic biology (SynBio), described as the engineering of biology, aims to develop new biological systems and to modify existing ones with predictable behaviours. The generation of nitrogen-fixing crops with low nitrogen input requirements is considered a challenge that could lead to a new agricultural “green” revolution. A potential approach for their generation is the direct transfer of bacterial nif genes needed for the biogenesis of nitrogenase into the plant genome. Chloroplasts (plastids) of higher plants have been proposed as possible subcellular compartments in which to engineer active nitrogenase, as they have the necessary properties to accommodate the assembly and function of the nitrogenase enzyme (reducing power and ATP abundance), despite their oxygenic environment. Chloroplast genome engineering has been achieved in several major crops. However, cereals remain elusive to this technique, imposing the need of using strategies that rely on the expression of nucleus-encoded transgenes with proteins being subsequently imported into plastids. The first part of this work reports the use of SynBio tools to optimize the production of nitrogenase Fe protein (NifH) in the chloroplasts of Nicotiana benthamiana plants. Azotobacter vinelandii nitrogen fixation genes nifH, M, U, and S were re-designed for protein accumulation in tobacco cells, and targeting to the chloroplast was optimized by screening minimal length transit peptides performing properly for each specific Nif protein. Putative peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NifM proved necessary for NifH solubility in the stroma. Importantly, NifH purified from tobacco chloroplasts was active in the reduction of acetylene to ethylene, with the requirement of NifU and NifS co-expression. In the second part, this thesis describes the translation of the lessons learned in tobacco to rice. The same set of A. vinelandii genes were re-designed for protein accumulation in Oryza sativa and the transit peptides selected for their performance in tobacco were tested for their efficiency in the import of a nuclear-encoded marker protein into plastids of different rice tissues, namely, callus, leaf, and root. Results showed that the A. thaliana minimal length transit peptides selected were also able to mediate Nif protein import into rice leaf chloroplasts. NifM, similar to what has been observed previously in bacteria, yeast and tobacco, proved necessary for NifH solubility in rice. However, we were unable to obtain rice transgenic plants accumulating any Nif protein in chloroplasts and thus, nitrogenase Fe protein activity in cereals remains elusive. Altogether, this thesis presents a proof of concept of the suitability of chloroplasts as organelles to host nitrogenase, and an optimization pipeline to engineer the reliable expression of any nuclear-encoded transgenes in N. benthamiana and O. sativa plastids, focusing on designing synthetic gene versions that confer higher protein accumulation and characterizing a set of chloroplast transit peptides that efficiently target their cargo proteins while minimizing scar amino acids in the mature protein after cleavage.