Tesis:
Effect of ageing on biochemical, genetic and epigenetic stability during seed storage
- Autor: PIRREDDA, Michela
- Título: Effect of ageing on biochemical, genetic and epigenetic stability during seed storage
- Fecha: 2021
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: https://oa.upm.es/69964/
- Director/a 1º: GONZÁLEZ BENITO, María Elena
- Director/a 2º: MIRA PÉREZ, Sara
- Resumen: La longevidad es un rasgo importante de la calidad de las semillas y depende de factores fisiológicos, genéticos y ambientales. La peroxidación de lípidos y la acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS) se asocian con frecuencia a los procesos de deterioro celular y se consideran grandes contribuyentes al envejecimiento de las semillas, causando daños al ADN y deterioro en las membranas plasmáticas. La longevidad de las semillas depende de las condiciones de almacenamiento, contenido de agua, temperatura y atmosfera; sin embargo, el mecanismo exacto de pérdida de viabilidad no se ha dilucidado por completo. La presente tesis estudia los posibles cambios bioquímicos, genéticos y epigenéticos que se producen durante el almacenamiento de semillas debido al envejecimiento en tres especies: Secale cereale, Mentha aquatica y Arabidopsis thaliana. Se almacenaron semillas de S. cereale a 15, 8, 3 y 1% de contenido de agua (wc) y 35 ºC en dos atmósferas (aire o vacío). Se determinó la viabilidad de las semillas, la pérdida de electrolitos, el contenido de malondialdehído (MDA) y la actividad de superóxido dismutasas y catalasas (SOD y CAT) en diferentes etapas del envejecimiento. Estos estudios se llevaron a cabo en la mayoría de los casos también en semillas embebidas y en plántulas producidas a partir de semillas almacenadas. Los resultados obtenidos indican que la pérdida de viabilidad está correlacionada con la permeabilidad de la membrana (pérdida de electrolitos) a 15% wc. La peroxidación de lípidos y la actividad de SOD y CAT no se correlacionaron con la viabilidad de las semillas. Se realizaron estudios para establecer la relación entre el deterioro de las semillas y la estabilidad genética y epigenética, mediante las técnicas Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) y Methylation Sensitive Amplification Polymorphism (MSAP), respectivamente. La integridad del ADN se vio comprometida durante el almacenamiento y no se reparó con la imbibición, ya que, aunque las semillas mostraban estabilidad genética después del almacenamiento, la similitud de las plántulas obtenidas de semillas almacenadas en comparación con las plántulas control fue menor. De manera similar, los cambios epigenéticos resultaron más evidentes en las plántulas que en las semillas después del almacenamiento. Además, se observó una disminución en la expresión del gen de superóxido dismutasa en plántulas producidas de semillas almacenadas, lo que indica un posible fallo del sistema antioxidante. Las semillas de M. aquatica se almacenaron a 12% wc y 35 ºC. Después de 28 días de almacenamiento (P50), se determinó la viabilidad, el contenido de MDA, y la integridad y la estabilidad epigenética del ADN, mediante RAPD y MSAP, respectivamente. Los resultados sugieren que la peroxidación lipídica podría estar relacionada con el deterioro de las semillas, al aumentar el contenido de MDA en las semillas almacenadas, pero también en las plántulas obtenidas de ellas. La integridad del ADN se vio afectada durante el almacenamiento y no se reparó con la imbibición, ya que los cambios genéticos y epigenéticos resultaron más evidentes en plántulas obtenidas de semillas almacenadas que en las propias semillas. Se almacenaron semillas de Arabidopsis thaliana a 75% de HR y 35 °C. Se llevaron a cabo experimentos para comprender el papel de la metilación del ADN y la expresión génica durante el envejecimiento de semillas. Se estudió la germinación de semillas del ecotipo Col-0 después del almacenamiento (P50), en presencia de un inhibidor de la actividad de la ADN metiltransferasa, lo que provocó una disminución de la germinación final. Se observó que las semillas del mutante hipermetilado ros1-4 mostraron una longevidad inferior a las del wild type (Col-0). Además, las semillas del mutante hipometilado cmt3 mostraron una longevidad mayor que las del wild type (Ws) cuando se desarrollaron bajo estrés térmico (27 ° C). La secuenciación de bisulfito del genoma completo (WGBS) se llevó a cabo en semillas Col-0 en diferentes momentos del almacenamiento, detectando que las Regiones Diferencialmente Metiladas (DMR) comunes disminuían con el tiempo, lo que sugiere que el almacenamiento causa una respuesta específica impulsada por la metilación del ADN. Finalmente, se analizó la expresión génica mediante la secuenciación de ARN del transcriptoma completo, y se observó que los conjuntos de genes up- y down-regulated variaron con la pérdida de viabilidad durante el almacenamiento. Los resultados indican que la metilación del ADN juega un papel importante en la longevidad de las semillas, cuyo alcance y modo de acción específico aún no se han esclarecido. ----------ABSTRACT---------- Seed longevity is an important trait of seed quality and it depends on physiological, genetic, and environmental factors. Understanding the mechanisms behind seed longevity, and establishing possible markers, is of fundamental importance, especially in the case of species with conservation problems in germplasm banks. Lipid peroxidation and ROS accumulation is frequently associated with seed deterioration processes and are considered great contributors to seed ageing causing DNA damage and membrane deterioration. Seed longevity is highly dependent on storage conditions, water content, temperature and atmosphere; nevertheless, the exact mechanism of seed viability loss has not been completely elucidated. The present thesis aimed to establish the possible biochemical, genetic and epigenetic changes produced during seed storage due to ageing with three species: Secale cereale, Mentha aquatica and Arabidopsis thaliana. S. cereale seeds were stored at 15, 8, 3 and 1% water content and 35 ºC in two atmospheres (air or vacuum). Viability, electrolyte leakage, malondialdehyde content, and catalase and superoxide dismutase (CAT and SOD) activities were determined at different stages during ageing. These studies were carried out in most cases also in imbibed seeds and in seedlings produced from stored seeds. The obtained results suggest that viability loss was strongly and linearly related to membrane permeability, measured by electrolyte leakage, at 15% wc. Lipid peroxidation, SOD and CAT activities were not related to seed viability. Further studies were carried out to establish the relationship between seed deterioration and genetic and epigenetic stability, by Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and Methylation Sensitive Amplification Polymorphism (MSAP) techniques, respectively. DNA integrity was compromised during storage and was not repaired upon imbibition, as, while seeds showed genetic stability after storage, the similarity of seedlings obtained from seeds stored was lower when compared to control seedlings. Similarly, epigenetic changes resulted more evident in seedlings that in seeds. In addition, a decrease in superoxide dismutase gene expression was observed in seedlings produced by stored seeds, indicating a possible failure of antioxidant system. M. aquatica seeds were stored at 12% wc and 35 ºC. Viability, MDA content, DNA integrity by RAPD, and epigenetic stability by MSAP techniques were determined after 28 days of storage, when 50% viability was lost. Results suggested that lipid peroxidation could be related to seed deterioration, as MDA content increased in stored seeds, but also in the seedlings obtained from them. DNA integrity was compromised during storage and was not repaired upon imbibition, and genetic and epigenetic changes resulted more evident in seedlings obtained from stored seeds than in the seeds themselves. Arabidopsis thaliana seeds were stored at 75% RH and 35 °C under air atmosphere. Several experiments were carried out to better understand DNA methylation and gene expression during seed ageing. Seed germination after storage of the wild ecotype Col-0 was tested in the presence of an inhibitor of DNA methyltransferase activity, causing a decrease in final germination. Seed longevity of the hyper-methylated mutant ros1-4 was compared to the wild ecotype showing faster ageing. When seeds had been developed under thermal stress (27 °C), the hypo-methylated mutant cmt3 showed increased longevity compared to the wild ecotype (Ws). Whole-genome bisulfite sequencing (WGBS) was carried out in Col-0 seeds at different times during storage, detecting that common Differentially Methylated Regions (DMRs) decreased with storage, suggesting that storage causes a specific response driven by DNA methylation. Finally, gene expression was analyzed by whole-transcriptome RNA-seq, and the sets of up- or downregulated genes varied with viability decline during storage. Results suggested that DNA methylation plays an important role in seed longevity, of which the extent and specific mode of action remains to be elucidated.