Tesis:
Computational prediction method to decipher receptor-glycoligand interactions in plant immunity
- Autor: HIERRO GARCÍA, Irene del
- Título: Computational prediction method to decipher receptor-glycoligand interactions in plant immunity
- Fecha: 2021
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: https://oa.upm.es/70709/
- Director/a 1º: MOLINA FERNÁNDEZ, Antonio
- Director/a 2º: MÉLIDA MARTÍNEZ, Hugo
- Resumen: A lo largo de la evolución, el sistema inmune de las plantas ha seleccionado las paredes celulares de plantas y microorganismos como fuente de Patrones Moleculares Asociados a Daño (DAMPs) o a Microorganismos (MAMPs). La percepción de estos patrones moleculares por los dominios extracelulares (ECD) de Receptores de Reconocimiento de Patrones (PRRs) desencadena respuestas inmunes. Dentro del inmenso número de ligandos que los PRRs vegetales pueden percibir, aquellos compuestos por azúcares están muy poco estudiados, así, un número muy reducido de complejos PRR/glicanos han sido determinados y caracterizados. En esta tesis presentamos un método computacional de cribado in silico que permite predecir nuevas interacciones de ECDs de PRRs con glicanos. Este método se basa en el primer paso de una simulación de dinámica molecular y ha sido desarrollado y optimizado con la familia LysM de PRRs de Arabidopsis thaliana. PRRs de esta familia como CERK1, LYK4 y LYK5 están implicados en la percepción de MAMPs de hongos tales como la quitina o ciertos β-1,3-glucanos. Nuestros resultados in silico predijeron las interacciones directas, ya descritas previamente, de CERK1 y LYK5 con el hexasacárido de quitina [β-1,4-D-(GlcNAc)6], a la vez que descartaban la interacción de este MAMP con LYK4. Por el contrario, no se detectó una unión de CERK1 con laminarihexaosa [β- 1,3-D-(Glc)6] a pesar de que CERK1 es necesario para la activación inmune mediada por este ligando, lo que indicaría que CERK1 podría ser un co-receptor para ciertos glicoligandos. Estos resultados in silico fueron validados in vitro mediante ensayos de calorimetría de los ECD recombinantes de CERK1, LYK4 y LYK5 con β-1,4-D- (GlcNAc)6 y β-1,3-D-(Glc)6. Para aumentar la robustez del método, se testó in silico la interacción de CERK1 con el carbohidrato β-1,4-D-(Glc)6 (celohexaosa), y se comprobó la ausencia de interacción, que fue validada experimentalmente estudiando las respuestas inmunes activadas por celohexaosa, que son similares en plantas silvestres y en el mutante cerk1 de Arabidopsis. Adicionalmente, el método desarrollado se validó analizando interacciones ya descritas de β-1,4-D-(GlcNAc)6 con CfAvr4 y Mg1LysM, así como la desaparición de interacciones entre CERK1 y dicho ligando tras mutaciones en residuos clave del ECD. En una segunda parte de esta tesis, se procedió al testado de PRRs del resto de familias de Arabidopsis con ECDs hipotéticamente capacitados para unir azúcares. Entre los PRRs testados se encuentran AtC-lectina, GmSusD, MmDECTIN-1, PDLP5, LORE, ANX1/2, THE1 y PR5K entre otros. Dichos PRRs fueron testados contra numerosos glicoligandos, entre los que se incluyen: oligosacáridos de quitina, β-glucanos, mananos y xilanos. Los resultados obtenidos permitieron refinar el protocolo de predicción, así como profundizar en el reconocimiento y caracterización de los ECDs de estos receptores. El poder predictivo de este protocolo computacional podría acelerar el descubrimiento y la caracterización de la interacción de glicanos con ECDs de PRRs o de otras proteínas, así como generar información relacionada con las respuestas inmunes activadas por nuevos glicoligandos y los aminoácidos de los dominios ECDs de los PRRs implicados en estas uniones. Estos avances contribuirán al desarrollo futuro de nuevos inmunomoduladores de las repuestas de resistencia de plantas a patógenos. ----------ABSTRACT---------- Throughout evolution, the plant immune system has selected plant and microorganisms cell walls as a source of Damage- or Microbe-Associated Molecular Patterns (MAMPs/DAMPs). The perception of those molecular patterns by the extracellular domains (ECDs) of Pattern Recognition Receptors (PRRs) triggers immune responses. From the vast number of ligands that plant PRRs can bind, those composed of carbohydrate moieties are poorly studied, and only a handful of PRR/glycan complexes have been determined and characterized. In this thesis we present a computational method for in silico predictions of new interactions of PRR-ECDs with glycans. This method is based on the first step of a Molecular Dynamics simulation and has been developed and optimized with the Arabidopsis thaliana LysM-PRR family. PRRs from this family like CERK1, LYK4 and LYK5 are involved in the perception of fungal MAMPs like chitin or some β-1,3-glucans. Our in silico results predicted the direct interactions, previously published, of CERK1 and LYK5 with the chitin hexasaccharide [β-1,4-D-(GlcNAc)6], at the same time that discarded the interaction of this MAMP with LYK4. On the contrary, an interaction of CERK1 with laminarihexaose [β-1,3-D-(Glc)6] was not detected, despite CERK1 is necessary for the immune activation mediated by this ligand, which suggests that CERK1 may act as a co-receptor in its recognition. These in silico results were validated in vitro with isothermal titration calorimetry assays of the recombinant ECDs of CERK1, LYK4 and LYK5 with β-1,4-D-(GlcNAc)6 and β-1,3-D-(Glc)6. To improve the robustness of the method, it was tested in silico the interaction of CERK1 with the carbohydrate β-1,4-D- (GlcNAc)6 (cellohexaose). The absence of interaction predicted was validated experimentally with the study of the immune responses activated by cellohexaose, similar in Arabidopsis wild-type and cerk1 mutant plants. Additionally, the developed method was corroborated by the study of other published interactions like CfAvr4 and Mg1LysM with β-1,4-D-(GlcNAc)6, as well as the disappearance of interactions between CERK1 and β-1,4-D-(GlcNAc)6 upon in silico mutations of CERK1-ECD key residues. In a second part of this thesis, we proceeded to the testing of the rest of PRR families of Arabidopsis putatively able to bind carbohydrates. The PRR tested were AtClectin, GmSusD, MmDECTIN-1, PDLP5, LORE, ANX1/2, THE1 and PR5K amongst others. Those PRRs were tested against several glycoligands like chitin oligosacharides, β-glucans, mannans and xylans. The retrieved results allowed the refinement of the prediction protocol and the study of the recognition and characterization of the receptor- ECDs. The predictive power of this computational protocol may accelerate the discovery and characterization of the interaction of glycans with PRR-ECDs or other proteins, as well as to generate information related to the immune responses activated by both novel glycoligands and the ECD-PRR residues involved in those interactions. These advances could contribute to the development of novel immunomodulators that can provide plant resistance to pathogens.