Tesis:
Study of interactions between predators and alphabaculoviruses
- Autor: GUTIÉRREZ CÁRDENAS, Oscar Giovanni
- Título: Study of interactions between predators and alphabaculoviruses
- Fecha: 2022
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
- Departamentos: PRODUCCION AGRARIA
- Acceso electrónico: https://oa.upm.es/71779/
- Director/a 1º: ADÁN DEL RÍO, Ángeles
- Director/a 2º: GARZÓN HIDALGO, Agustín
- Resumen: In the current context of human population growth and climate change, it is essential to optimize a sustainable pest control management, reducing when possible the use of chemical strategies. This management must prioritize techniques such as biological control, which includes both the use of entomopathogens and entomophagous insects. Based on the above, the general objective of this Doctoral Thesis was to study, under laboratory conditions, the interactions between three isolates of the genus Alphabaculovirus (Baculoviridae) and the generalist predators Chrysoperla carnea (Stephens, 1836) (Neuroptera: Chrysopidae) and Nesidiocoris tenuis (Reuter, 1895) (Hemiptera: Miridae), in order to advance in an efficient integration of micro and macrobiological control strategies as well as in the management of the lepidopteran pests Spodoptera exigua (Hübner, 1808) and Spodoptera littoralis (Boisduval, 1833) (Lepidoptera: Noctuidae). The first research line of this Thesis aimed to study the interactions between C. carnea and the baculoviruses Spodoptera exigua Multiple Nucleopolyhedrovirus (SeMNPV) and Autographa californica Multicapsid Nuclear Polyhedrosis Virus (AcMNPV), when they share S. exigua larvae as prey and host. On the one hand, choice tests were carried out between non-infected and baculovirus-infected prey through different combinations: A) second larval instar (L2) non-infected larvae of S. exigua vs adults of Macrosiphum euphorbiae (Thomas, 1878) (Hemiptera: Aphididae); B) non-infected L2 S. exigua larvae vs L2 larvae infected with the Lethal Concentration 95 (LC95) of SeMNPV and AcMNPV, respectively; C) L2 S. exigua larvae infected with the LC95 of SeMNPV and AcMNPV, respectively vs adults of M. euphorbiae. In these trials, the type of prey selected (first attack) was recorded, as well as the time elapsed until the first attack occurred (searching time). The results obtained indicated that third instar larvae (L3) of C. carnea did not discriminate between non-infected and infected S. exigua larvae (20 vs 22 attacks for SeMNPV, and 21 vs 19 for AcMNPV). However, a statistically significant preference for S. exigua larvae (non-infected or infected) over M. euphorbiae adults was recorded in all cases (34 vs 12 attacks, and 33 vs 7 attacks, respectively). In any case significant differences were recorded in the searching time spent by the predator to capture the prey. On the other hand, it was evaluated on L3 C. carnea larvae the influence of the consumption of LC95-infected S. exigua larvae [3 days post inoculation (d.p.i.)] with SeMNPV and AcMNPV, respectively. Regarding the survival of predator larvae and pupae, no significant differences were observed between the consumption of non-infected or infected larvae. In addition, the results obtained from the daily consumption rate of S. exigua larvae did not show significant differences between treatments (8.70, 8.52 and 8.69, for non-infected, SeMNPV and AcMNPV-infected, respectively). However, a significant delay in the developmental time of L3 C. carnea was recorded when they fed on baculovirus infected larvae (half a day more for SeMNPV, and one day more for AcMNPV). Regarding the duration of the pupal phase and the preoviposition period, only the treatment with AcMNPV significantly extended their duration compared to the treatments with SeMNPV and non-infected larvae (11.09, 9.70 and 9.62 days respectively for pupal phase; 6.67, 5.50 and 5.25 days respectively for preoviposition period). For pupae weight, both treatments with baculovirus significantly reduced the values in comparison to the control. However, the weight of adults [female (♀) and male (♂)] did not show significant differences between treatments. Regarding the reproductive parameters, there seemed to be a tendency towards lower fecundity values in treatments with infected larvae, without statistically significant results, while fertility was high (80-90 %) and similar in all treatments, also without significant differences. The second research line of this Thesis aimed to evaluate the acquisition and excretion of the occlusion bodies (OBs) of the baculoviruses SeMNPV and AcMNPV by C. carnea after feeding on infected S. exigua larvae. Chrysoperla carnea larvae fed ad libitum for 4-6 days (until pupation) on L2 larvae of S. exigua infected with the baculoviruses SeMNPV and AcMNPV, obtaining dry residues from predator´s excretion drops and meconia once the adult stage was reached. After suspending the excretion products in distilled water, the OBs were counted. Subsequently, the infection of S. exigua larvae was carried out in two different ways: first, via inoculation through the suspensions obtained from drops and meconia (droplet ingestion technique), and second, through direct exposure to the excretion products on the artificial diet of S. exigua. The results confirmed the presence of OBs in both excretion products, and the Two-way analysis of variance (ANOVA) revealed significant differences for the excretion product (droplets vs meconium). The mortality with both SeMNPV and AcMNPV meconia suspensions was 100 % due to the high concentrations of OBs, while the excretion drops suspensions caused a mortality of 85.70 % and 78.60 % for SeMNPV and AcMNPV, respectively. In direct deposition of the excretion products, SeMNPV drops significantly reduced the Median Time to Death (MTD) compared to meconia treatments. The mortality recorded in this application method was 96.40 % for SeMNPV excretion drops and 100 % for the rest of treatments. From the analysis of the survival curves, significant differences were obtained in the speed with which the evaluated treatments caused larval mortality, finding that the highest viral concentrations detected in the meconia suspensions accelerated the evolution of the disease compared to excretion drops suspensions, which confirms the results of the Two-way analysis of variance performed. The third research line explored the acquisition and transmission of baculoviruses by C. carnea and N. tenuis when feeding on Ephestia kuehniella Zeller 1879 (Lepidoptera: Pyralidae) eggs contaminated by immersion with OBs of SeMNPV and Spodoptera littoralis Multiple Nucleopolyhedrovirus (SpliMNPV), without the mediation of infected prey. In these bioassays, the exposure of lepidopteran larvae to the excretion products of predators always took place on tomato plant leaflets (Solanum lycopersicum L.). In the case of C. carnea, the estimation of OBs in the excretion products was positive both for drops and meconia, but with higher concentration in the latter. For N. tenuis, the presence of OBs was also confirmed, but counting was not performed due to the small size of excretion drops. In the study of baculovirus transmission through the excretion products, L3 larvae of C. carnea dispersed the virus after feeding 48 h on the treated diet (LC95 × 20) and excreting for 24 h on tomato leaflets. The mortality results of S. littoralis larvae after feeding 72 h on the leaflets, showed significant differences between the negative control and the two treatments with SpliMNPV (corresponding to 2 larval densities studied: 4 and 8 larvae/leaflet), being similar between both C. carnea larval densities. The mean mortality time did not present significant differences between the two densities. Regarding the results obtained in the dispersion of SeMNPV by N. tenuis adults, the predator was able to spread the virus, infecting non-infected S. exigua larvae, with significant differences between the evaluated treatments [final mortality of 55.23 % for the treatment with E. kuehniella eggs + SeMNPV (LC95 × 20), and 100 % for the positive control]. The mean mortality time showed significant differences between the evaluated treatments, with a MTD of 9.86 days for the treatment with E. kuehniella eggs + SeMNPV (LC95 × 20), and 4.73 days for the positive control. In a second trial, the horizontal transmission of SpliMNPV (LC95 × 50) in tomato plants was evaluated. Adults of N. tenuis remained on plants for 3 days, and then were then replaced by L2 S. littoralis larvae that remained for 5 days before being transferred to the artificial diet. A mortality of 51.62 % was recorded, with significant differences compared to the negative control. In the fourth research line addressed, a sucrose solution diet (0.5 M) (SUC treatment) was compared with E. kuehniella eggs (EPHES treatment) for the acquisition of the SpliMNPV baculovirus (LC95 × 20). In a first trial, the SUC treatment significantly increased the mortality of the pest (81.23 %) compared to EPHES (50.47 %), but did not reach that of the positive control (100 %). Similarly, the MTD showed significant differences between the evaluated treatments (7.07 days for SUC, and 15.00 days for EPHES), while for the positive control was 2.00 days. With the corpses recovered from the host, a second cycle of infection was carried out, which was very virulent (100 % mortality of the pest in five days for both treatments). In a second trial, the influence of predator´s density (number of adult couples per tomato leaflet) was evaluated on the efficiency of virus transmission, as well as the retention time of the virus by N. tenuis after feeding on a treated diet for 48 h. The methodology followed was similar to that described above. Pest mortality significantly increased with higher numbers of N. tenuis used to contaminate leaflets. Regarding virus retention, the results varied with the diet factor. In the EPHES treatment, the mortalities recorded at 0, 3, 6, and 9 days were not significantly different and ranged from 41 to 61 % mortality. On the contrary, in the case of SUC, the initial infection was more virulent than in EPHES, but it was significantly reduced after 9 days, with the mortality of S. littoralis varying between 25 and 81 %. Except for time 0 and density of 8 adults of N. tenuis, with an estimated mean mortality time of 10 days, the rest of times varied between 22 and 27 days with a tendency to increase as the retention time tested was extended. Finally, a clear delay in pupation was recorded in surviving larvae that had been exposed to SpliMNPV OBs compared to the negative control. Another infection test of S. littoralis larvae was carried out, reducing the concentration of SpliMNPV (LC95 × 10), as well as the feeding times of the predator in the SUC and EPHES treatments (24 h), and of the pest in the tomato leaflets (24 and 72 hours). The same trial was repeated on the three consecutive days after cessation of feeding of the predator in the treated diets (T0, T1 and T2). By reducing the concentration of the virus, the mortality recorded in S. littoralis was lower, especially when the larvae only fed 24 h on contaminated plant. As a final point, an additional test was carried out to evaluate the effect of ingestion of the SpliMNPV baculovirus for 48 h on the longevity of females and males, and on the production of N. tenuis nymphs. The results of the Two-way ANOVA did not show significant differences in terms of longevity between the factors of sex and ingested diet. There were also no significant differences in the offspring of the three treatments evaluated (SUC, EPHES and negative control), respectively. From the results obtained in this Doctoral Thesis, it can be inferred that field predation of baculovirus-infected lepidopteran larvae by L3 C. carnea is a reasonable hypothesis. Besides, the possible adverse effects derived from the consumption of baculovirus-infected prey (mainly related to lower nutritional quality) are expected to be reduced under a field scenario, because of a wider range of prey for C. carnea. The presence of OBs in predator’s excreta after feeding on infected prey reveals its potential as dispersive agent. Also, the acquisition by C. carnea and N. tenuis of baculovirus OBs via commercial diet (E. kuehniella eggs) opens a promissory line for massive rearing factories to be implemented prior to field releasing of natural enemies. In the present study, the suitability of alternative diets for N. tenuis (such as sucrose solution) containing baculovirus OBs has been assessed with positive results in terms of transmission. Finally, this Doctoral Thesis contributes to the generation of basic knowledge on the exploration of the potential of the generalist predators C. carnea and N. tenuis in the transmission of baculoviruses by serving as vehicles for their inoculative application in the management of lepidopteran pests. ----------RESUMEN---------- En el contexto actual de crecimiento de la población humana y de cambio climático, es fundamental optimizar las estrategias de control de plagas más sostenibles, reduciendo siempre que sea posible el uso de métodos químicos. Este manejo debe dar prioridad a técnicas como el control biológico, que integra el uso tanto de entomopatógenos como de entomófagos. Con base en lo anterior, el objetivo general de esta Tesis Doctoral fue estudiar en condiciones de laboratorio, las interacciones entre tres aislados del género Alphabaculovirus (Baculoviridae) y los depredadores generalistas Chrysoperla carnea (Stephens, 1836) (Neuroptera: Chrysopidae) y Nesidiocoris tenuis (Reuter, 1895) (Hemiptera: Miridae), para avanzar en un uso integrado y más eficiente de estrategias de control micro y macrobiológico, así como en el manejo de las plagas de lepidópteros Spodoptera exigua (Hübner, 1808) y Spodoptera littoralis (Boisduval, 1833) (Lepidoptera: Noctuidae). La primera línea de investigación de esta Tesis tuvo como objetivo estudiar las interacciones entre C. carnea y los baculovirus Spodoptera exigua Multiple Nucleopolyhedrovirus (SeMNPV) y Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus (AcMNPV), cuando comparten larvas de S. exigua como presa y hospedante. Por un lado, se realizaron ensayos de elección entre presas no infectadas e infectadas por baculovirus mediante diferentes combinaciones: A) larvas no infectadas de segundo estadio larvario (L2) de S. exigua vs adultos de Macrosiphum euphorbiae (Thomas, 1878) (Hemiptera: Aphididae); B) larvas L2 de S. exigua no infectadas vs larvas L2 infectadas con la concentración letal 95 (CL95) de SeMNPV y AcMNPV, respectivamente; C) larvas L2 infectadas con la CL95 de SeMNPV y AcMNPV, respectivamente vs adultos ápteros de M. euphorbiae. En estos ensayos se registró el tipo de presa seleccionada (primer ataque), así como el tiempo transcurrido hasta que se produjo el primer ataque (tiempo de búsqueda). Los resultados obtenidos indicaron que las larvas de tercer estadio (L3) de C. carnea no discriminaron entre larvas de S. exigua no infectadas e infectadas (20 vs 22 ataques para SeMNPV, y 21 vs 19 para AcMNPV). Sin embargo, en todos los casos se registró una preferencia estadísticamente significativa por larvas de S. exigua (no infectadas o infectadas) sobre adultos de M. euphorbiae (34 vs 12 ataques; y 33 vs 7 ataques, respectivamente). En cualquier caso, no se registraron diferencias significativas en el tiempo de búsqueda empleado por el depredador para capturar a la presa. Por otro lado, se evaluó la influencia sobre larvas L3 de C. carnea del consumo de larvas de S. exigua infectadas con la CL95 [3 días post-inoculación (d.p.i.)] con SeMNPV y AcMNPV. En cuanto a la supervivencia de larvas y pupas del depredador, no se observaron diferencias significativas entre el consumo de larvas no infectadas o infectadas. Además, los resultados obtenidos de la tasa de consumo diaria de larvas no mostraron diferencias significativas entre los tratamientos evaluados (8.70, 8.52 y 8.69, para no infectadas, e infectadas con SeMNPV y AcMNPV, respectivamente). Sin embargo, se registró un retraso significativo en el tiempo de desarrollo del estadio L3 de C. carnea cuando se alimentaron de larvas infectadas con baculovirus (medio día más para SeMNPV y un día más para AcMNPV). En cuanto a la duración de la fase de pupa y el periodo de preoviposición, solo el tratamiento con AcMNPV prolongó significativamente su duración en comparación con los tratamientos con SeMNPV y larvas no infectadas (11.09, 9.70 y 9.62 días respectivamente para la fase de pupa; 6.67, 5.50 y 5.25 días respectivamente para el periodo de preoviposición). Para el peso de pupas, ambos tratamientos con baculovirus redujeron significativamente los valores en comparación con el control. Sin embargo, el peso de los adultos [hembra (♀) y macho (♂)] no mostró diferencias significativas entre tratamientos. En cuanto a los parámetros reproductivos, pareció haber una tendencia hacia valores más bajos de fecundidad en los tratamientos con larvas infectadas sin resultados estadísticamente significativos, mientras que la fertilidad fue alta (80-90 %) y similar en todos los tratamientos, sin diferencias significativas. La segunda línea de investigación de esta Tesis, tuvo como objetivo evaluar la adquisición y excreción de cuerpos de oclusión (OBs) de los baculovirus SeMNPV y AcMNPV por parte de C. carnea tras alimentarse de larvas de S. exigua infectadas. A partir de larvas de C. carnea alimentadas ad libitum durante 4-6 días (hasta alcanzar la etapa de pupa) con larvas L2 de S. exigua infectadas con los baculovirus SeMNPV y AcMNPV, se obtuvieron los residuos secos de las gotas de excreción y meconio del depredador una vez alcanzado el estado adulto. Después de suspender los productos de excreción en agua destilada, se contaron los OBs. Posteriormente, la infección de larvas de S. exigua se llevó a cabo de dos formas diferentes: primero, mediante la inoculación a través de las suspensiones obtenidas de gotas y meconio (técnica de ingestión de gotas), y segundo, mediante la exposición directa a los productos de excreción en la dieta artificial de S. exigua. Los resultados confirmaron la presencia de OBs en ambos productos de excreción, y el análisis de varianza de dos vías (ANOVA) reveló diferencias significativas para los productos de excreción (gotas vs meconio). La mortalidad obtenida con las suspensiones de meconio tanto para SeMNPV como para AcMNPV fue de 100 % debido a las elevadas concentraciones de OBs, mientras que las suspensiones de gotas de excreción causaron una mortalidad de 85.70 % y 78.60 % para SeMNPV y AcMNPV respectivamente. En la deposición directa de los productos de excreción, las gotas de excreción de SeMNPV redujeron significativamente el Tiempo Medio de Mortalidad (TMM) en comparación con los tratamientos con meconio. La mortalidad registrada con este método de aplicación fue 96.40 % para las gotas de excreción de SeMNPV y 100 % para el resto de tratamientos. Del análisis de las curvas de supervivencia se obtuvieron diferencias significativas en la rapidez con que los tratamientos evaluados provocaron la mortalidad larvaria, encontrándose que las mayores concentraciones virales detectadas en las suspensiones de meconio aceleraron la evolución de la enfermedad en comparación con las suspensiones de gotas de excreción, lo que confirma los resultados del ANOVA de dos vías realizado. La tercera línea de investigación exploró la adquisición y transmisión de baculovirus por parte de C. carnea y N. tenuis al alimentarse de huevos de Ephestia kuehniella Zeller 1879 (Lepidoptera: Pyralidae) contaminados por inmersión con OBs de SeMNPV y Spodoptera littoralis Multiple Nucleopolyhedrovirus (SpliMNPV), sin la mediación de presas infectadas. En estos bioensayos, la exposición de las larvas de lepidópteros a los productos de excreción de los depredadores se realizó siempre sobre foliolos de plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.). En el caso de C. carnea, la estimación de OBs en los productos de excreción fue positiva tanto para gotas como para meconios, pero con mayor concentración en estos últimos. Para N. tenuis también se confirmó la presencia de OBs, pero no se pudo realizar el conteo debido al pequeño tamaño de las gotas de excreción. En el estudio de la transmisión de baculovirus a través de los productos de excreción, las larvas L3 de C. carnea dispersaron el virus después de alimentarse durante 48 h con la dieta tratada (CL95 × 20) y excretaron durante 24 h en foliolos de tomate. Los resultados de mortalidad de larvas de S. littoralis tras alimentarse 72 h sobre foliolos de tomate, mostraron diferencias significativas entre el control negativo y los dos tratamientos con SpliMNPV (correspondientes a 2 densidades larvarias estudiadas: 4 y 8 larvas/foliolo), siendo similares los resultados obtenidos entre las dos densidades. El TMM no presentó diferencias significativas entre las dos densidades. En cuanto a los resultados obtenidos en la dispersión de SeMNPV por adultos de N. tenuis, el depredador fue capaz de propagar el virus, infectando larvas de S. exigua no infectadas, con diferencias significativas entre los tratamientos evaluados [mortalidad final de 55.23 % para el tratamiento con huevos de E. kuehniella + SeMNPV (CL95 × 20), y 100 % para el control positivo]. El TMM mostró diferencias significativas entre los tratamientos evaluados, siendo de 9.86 días para el tratamiento con huevos de E. kuehniella + SeMNPV (CL95 × 20), y de 4.73 días para el control positivo. En un segundo ensayo se evaluó la transmisión horizontal de SpliMNPV (CL95 × 50) en plantas de tomate. Los adultos de N. tenuis permanecieron en las plantas durante 3 días, y luego fueron reemplazados por larvas L2 de S. littoralis, que permanecieron durante 5 días antes de ser transferidas a dieta artificial. Se registró una mortalidad de 51.62 %, con diferencias significativas respecto al control negativo. En la cuarta línea de investigación abordada, se comparó una dieta en solución de sacarosa (0.5 M) (tratamiento SUC) con huevos de E. kuehniella (tratamiento EPHES) para la adquisición del baculovirus SpliMNPV (CL95 × 20). En un primer ensayo, el tratamiento SUC incrementó significativamente la mortalidad de la plaga (81.23 %) en comparación con EPHES (50.47 %), pero no alcanzó la del control positivo (100 %). De igual forma, el TMM mostró diferencias significativas entre los tratamientos evaluados (7.07 días para SUC y 15.00 días para EPHES), mientras que para el control positivo fue de 2.00 días. Con los cadáveres recuperados del hospedante, se realizó un segundo ciclo de infección, el cual fue muy virulento (100 % de mortalidad de la plaga en 5 días para ambos tratamientos evaluados). En un segundo ensayo se evaluó la influencia de la densidad de depredadores (número de parejas de adultos por foliolo de tomate) sobre la eficiencia de transmisión del virus, así como el tiempo de retención del virus por parte de N. tenuis tras alimentarse con una dieta tratada durante 48 horas. La metodología seguida fue similar a la descrita anteriormente. La mortalidad de la plaga aumentó significativamente con un mayor número de N. tenuis utilizados para contaminar los foliolos. En cuanto a la retención del virus, los resultados variaron con el factor dieta. En el tratamiento con EPHES, las mortalidades registradas a los 0, 3, 6 y 9 días no fueron significativamente diferentes y oscilaron entre 41 y 61 % de mortalidad. Por el contrario, en el caso de SUC, la infección inicial fue más virulenta que en EPHES, pero se redujo significativamente a los 9 días, variando la mortalidad de S. littoralis entre 25 y 81 %. Exceptuando el tiempo 0 y densidad de 8 adultos de N. tenuis, con un tiempo medio de mortalidad estimado de 10 días, el resto de tiempos varió entre 22 y 27 días, con tendencia a aumentar a medida que se alargaba el tiempo de retención ensayado. Finalmente, se registró un claro retraso en la pupación de las larvas sobrevivientes que habían estado expuestas a cuerpos de oclusión de SpliMNPV en comparación con el control negativo. Se realizó otra prueba de infección de larvas de S. littoralis, reduciendo la concentración de SpliMNPV (CL95 × 10), así como los tiempos de alimentación del depredador en los tratamientos SUC y EPHES (24 h), y de la plaga en foliolos de tomate (24 y 72 horas). El mismo ensayo se repitió en los tres días consecutivos posteriores al cese de la alimentación del depredador en las dietas tratadas (T0, T1 y T2). Al reducir la concentración del virus, la mortalidad registrada en S. littoralis fue menor, especialmente cuando las larvas solo se alimentaron durante 24 h. Además, se realizó una prueba adicional para evaluar el efecto de la ingestión del baculovirus SpliMNPV durante 48 h sobre la longevidad de hembras y machos, y sobre la producción de ninfas de N. tenuis. Los resultados del ANOVA de dos vías no mostraron diferencias significativas en términos de longevidad entre los factores sexo y dieta ingerida. Tampoco hubo diferencias significativas en la descendencia de los tres tratamientos evaluados (SUC, EPHES y control negativo), respectivamente. De los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral se puede inferir que la depredación en condiciones de campo de larvas de lepidópteros infectadas con baculovirus por parte de larvas L3 de C. carnea es una hipótesis razonable. Además, es previsible que los posibles efectos adversos derivados de la ingesta de presas infectadas con baculovirus (fundamentalmente relacionados con la menor calidad nutricional) se reduzcan en campo, debido al mayor rango de presas de C. carnea. La presencia de OBs en los productos de excreción del depredador tras el consumo de presas infectadas revela su potencial como agente dispersor. Por otra parte, la adquisición por C. carnea y N. tenuis de OBs a través de dieta comercial (huevos de E. kuehniella) tratada, abre una línea promisoria para las biofábricas de enemigos naturales, que podrían implementarla antes de la liberación en campo de los agentes de control. En el presente trabajo, también se ha evaluado la idoneidad de dietas alternativas para N. tenuis (como la solución de sacarosa) a las que se integran los OBs del baculovirus, con resultados positivos en cuanto a transmisión. Finalmente, esta Tesis Doctoral contribuye a la generación de conocimientos básicos sobre la exploración del potencial de los depredadores generalistas C. carnea y N. tenuis en la transmisión de baculovirus, al servir como vehículos para su aplicación inoculativa en el manejo de plagas de lepidópteros.