Tesis:
Identification of optimal NifH and NifB proteins for nitrogenase engineering in eukaryotes
- Autor: JIANG CHEN, Xi
- Título: Identification of optimal NifH and NifB proteins for nitrogenase engineering in eukaryotes
- Fecha: 2022
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: FACULTAD DE INFORMATICA
- Departamentos: AEROTECNIA
- Acceso electrónico: https://oa.upm.es/70306/
- Director/a 1º: RUBIO HERRERO, Luis Manuel
- Director/a 2º: BURÉN, Stefan
- Resumen: The climate change and its consequences are currently of particular concern to both policymakers and the general public. Synthetic nitrogen fertilizers that emerged during the Second Industrial Revolution at the beginning of the 20th century are important contributors to the emission of greenhouse gases and the destruction of the ozone layer, in addition to other negative effects on the environment such as water pollution and loss of biodiversity. The problems associated with the production and use of synthetic nitrogen fertilizers, which are necessary to sustain high crop yields to feed the growing world population, could therefore be alleviated by the transfer of biological nitrogen fixation (BNF) capacity into crop species. BNF is only found in some prokaryotic organisms called diazotrophs that harbor a nitrogenase enzymatic complex that reduces N2 to NH3. Nitrogenase is formed by the structural proteins NifH and NifDK and requires, in addition to these three gene products, at least the NifB and NifEN proteins, as these synthesize the nitrogenase active-site metal cofactor. Transfer of nitrogenase to plants faces three main obstacles: 1) the genetic complexity of the nif (nitrogen fixation) regulon, 2) the oxygen sensitivity of the metal clusters necessary for the function of the enzymatic complex and, finally, 3) the soluble accumulation of these Nif proteins. For example, NifH and NifB expression has been limited due to insolubility and instability when expressed in plant mitochondria and chloroplasts, the two organelles that have been proposed as subcellular compartments that could provide the large amounts of reducing power and energy necessary for nitrogenase activity, although oxygen produced in the chloroplast during photosynthesis could limit nitrogenase functionality in this organelle. Two key components to engineer nitrogenase in crops are: 1) NifH, an O2- sensitive structural component of the nitrogenase enzyme required at high cellular concentrations; and 2) NifB, an essential enzyme for the synthesis of the active-site cofactor for all types of nitrogenase. In this thesis, we established a pipeline to identify NifH and NifB proteins suitable for plant engineering and use them to obtain transgenic rice lines. First, NifH and NifB variants from genetically diverse diazotrophs were studied to identify soluble, stable, and active variants when expressed in tobacco mitochondria and chloroplasts. Two gene libraries containing 32 nifH and 30 nifB variants were expressed and targeted to tobacco mitochondria (for NifH) or tobacco mitochondria and chloroplasts (for NifB). The NifH library screening in tobacco identified a superior NifH variant from the bacterium Hydrogenobacter thermophilus TK-6. The NifH polypeptide accumulated in soluble form at high levels in mitochondria of yeast, tobacco and rice, and showed in vitro activity when purified from all three Eukaryotic species. The NifB library screening in tobacco identified NifB variants from the archaea Methanocaldococcus infernus, Methanothermobacterium thermautotrophicus and Methanosarcina acetivorans as soluble, stable and active when purified from tobacco mitochondria and/or chloroplasts. Transgenic rice lines accumulating M. infernus or M. thermautotrophicus NifB proteins in mitochondria were also generated from where NifB proteins that supported in vitro FeMoco synthesis could be isolated. The results presented in this thesis demonstrate that it is possible to identify proteins with enhanced stability and solubility, by screening knowledge-based genetic libraries consisting of homologous proteins of diverse phylogenetic origin. The identification and expression of one variant of NifH, and three variants of NifB, with superior properties in tobacco and rice lays the foundation for the transfer of nitrogen fixation capacity into crops of agronomic and economic interest. ----------RESUMEN---------- El cambio climático y sus consecuencias son actualmente objeto de especial preocupación tanto por la clase política como la población general. Los fertilizantes nitrogenados sintéticos surgidos durante la Segunda Revolución Industrial a principios del siglo XX contribuyen de directamente a la emisión de gases de efecto invernadero y a la destrucción de la capa de ozono, además de otros efectos negativos sobre el medio ambiente como la contaminación de las aguas y la pérdida de la biodiversidad. Por ello, los problemas asociados a la producción y el uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos, necesarios para mantener un alto rendimiento de los cultivos, podrían ser reducidos mediante la transferencia de la capacidad de fijación biológica del nitrógeno (FBN) a las especies cultivadas. La BNF solo se encuentra en algunos organismos procariotas (diazotrofos) que albergan el complejo enzimático de la nitrogenasa que reduce N2 a NH3. La nitrogenasa está formada por las proteínas estructurales NifH y NifDK y requiere de al menos las proteínas NifB y NifEN, que sintetizan el cofactor metálico del sitio activo de la nitrogenasa. La transferencia de la nitrogenasa a las plantas se enfrenta a tres obstáculos principales 1) la complejidad genética del regulón nif (nitrogen fixation), 2) la labilidad al oxígeno de los cluster metálicos necesarios para la función del complejo enzimático y, por último, 3) la acumulación soluble de proteínas Nif. Por ejemplo, la expresión de NifH y NifB se ha visto limitada debido a su insolubilidad e inestabilidad cuando se expresan en mitocondrias y cloroplastos de plantas, los dos orgánulos propuestos como compartimentos subcelulares que podrían proporcionar las cantidades de poder reductor y energía necesarias para la actividad nitrogenasa. No obstante, el oxígeno producido en el cloroplasto durante la fotosíntesis podría limitar la función de la ennzima. Dos componentes clave para la bioingeniería de la nitrogenasa en cultivos son 1) NifH, componente estructural de la enzima nitrogenasa y necesaria a altas concentraciones celulares; y 2) NifB, enzima esencial para la síntesis del precursor común de los cofactores de las tres nitrogenasas. En esta tesis, se estableció una línea de trabajo para identificar las proteínas NifH y NifB adecuadas para su bioingeniería en plantas y utilizarlas para obtener líneas de arroz transgénicas. En primer lugar, se estudiaron variantes de NifH y NifB de diversos diazotrofos para identificar variantes solubles, estables y activas cuando se expresan en mitocondrias y cloroplastos de tabaco. Se expresaron dos librerías de genes que contenían 32 variantes de nifH y 30 de nifB y se dirigieron a las mitocondrias de tabaco (para NifH) o a las mitocondrias y cloroplastos de tabaco (para NifB). El cribado de la librería de NifH en tabaco permitió identificar una variante NifH superior procedente de la bacteria Hydrogenobacter thermophilus TK-6. NifH se acumuló en forma soluble a altos niveles en las mitocondrias de levadura, tabaco y arroz, y mostró actividad in vitro cuando se purificó de las tres especies eucariotas. El cribado de la librería de NifB en tabaco identificó variantes NifB de las archaeas Methanocaldococcus infernus, Methanothermobacterium thermautotrophicus y Methanosarcina acetivorans como solubles, estables y activas cuando se purificaron de mitocondrias y/o cloroplastos de tabaco. También se generaron líneas transgénicas de arroz que acumulaban NifB de M. infernus o M. thermautotrophicus en las mitocondrias, de las cuales se pudieron aislar las proteínas NifB que eran competentes en la síntesis in vitro de FeMo-co. Los resultados presentados en esta tesis demuestran que es posible identificar proteínas con mejor estabilidad y solubilidad mediante el cribado de librerías genéticas basadas en conocimiento y compuestas por proteínas homólogas de diverso origen filogenético. La identificación y expresión de una variante de NifH, y tres variantes de NifB, con propiedades superiores en tabaco y arroz, sienta las bases para la transferencia de la capacidad de fijación de nitrógeno a cultivos de interés agronómico y económico.