Tesis:
Laser bioprinting for single cell biological studies = Bioimpresión por láser para estudios biológicos de célula única
- Autor: MÁRQUEZ FERNÁNDEZ, Andrés
- Título: Laser bioprinting for single cell biological studies = Bioimpresión por láser para estudios biológicos de célula única
- Fecha: 2021
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: FACULTAD DE INFORMATICA
- Departamentos: AEROTECNIA
- Acceso electrónico: https://oa.upm.es/66183/
- Director/a 1º: MOLPECERES ALVAREZ, Carlos Luís
- Director/a 2º: LAUZURICA SANTIAGO, Sara
- Resumen: Bioprinting is a new discipline used for the creation of engineered tissues, organs or constructs that performs any biological function. It is an interdisciplinary field of study, including areas like engineering, biology, medicine, physics, and many more. Throughout the years several bioprinting technologies have risen each with its own unique approach, but currently the three main ones are extrusion, drop and laser-based printing. This work focuses on the development of a new laser-based bioprinting technique for single cell printing and isolation using the core concepts of Laser Induced Forward Transfer (LIFT). LIFT uses the energy of a focused laser beam to transfer droplets of the biomaterial into a target. The technique proposed is based on a LIFT variation called Blister Actuated LIFT (BA-LIFT) that uses a thick layer as a protective interface between the laser beam and the biomaterial. This layer works both as the driving force to transfer the biomaterial and as a protective layer from radiation and heat of the laser. For the development of the technique the investigation is divided in five phases. On the first phase the first a set of initial experiments were performed using a semiconductive polymer known as P3HT as interface layer. The main reason of using this polymer is because of its capabilities of absorbing light in the visible range of the spectrum enabling the use of a laser emitting in this range. Visible light is potentially less harmful to living material so using a visible laser could help in the cell viability. Although results show that it is possible to transfer biomaterial using P3HT, several complications showed it was not the best approach. On the second phase of the investigation a new polymer was proposed, a polyimide adhesive tape. In this phase all experiments related to the relevant characterization of this material and together with the deposition of the biomaterial are presented. The results show that the polyimide is an excellent candidate to be used for BA-LIFT as it meets all characteristics required in terms of biocompatibility and liquid layer deposition. Liquid layer deposition is shown to be the most sensitive parameter of the process. The third phase covers the first proof of concept of printing with the proposed polyimide. A galvanometric scanner is used to move the laser beam focused on the substrate that contains the biomaterial. Pattern printing was proven successful and even single cell printing, although for the main application of the investigation that is specific single cell selection it is not the best approach. On the fourth phase the final benchtop setup is presented where the galvanometric scanner is replaced with a microscope objective. Taking advantage of the microscope, a vision system was placed coaxial with the laser path allowing to target the cells and transfer them on the spot. Also, a fluorescence system was installed together with the conventional vision enabling targeting of cells marked with fluorochromes. On the fifth and final phase the benchtop system was used as base for the design of machine implementing all features developed along the investigation. This machine was designed in collaboration with a start-up incorporated by the research group in which this work has been developed, Innofluence and was used to finish this work with the demonstration of the technique with more complex applications. The applications presented on this phase are single cell isolation using biomarkers, natural killer cell isolation to demonstrate its activation capabilities post isolation, hematopoietic and progenitor stem cell isolation for the assessment of colony forming units and circulating tumor cell isolation. All applications were successful, opening the gate for the development of more experiments that require single cell recognition and isolation. ----------RESUMEN---------- La bioimpresión es una nueva disciplina usada para la creación de tejidos, órganos, o cualquier tipo de estructura que desempeña una función biológica. Es un campo de estudio interdisciplinario incluyendo áreas que incluyen la ingeniería, biología, medicina, física y muchas más. A través de los años se han desarrollado distintas tecnologías de bioimpresión cada una aportando soluciones específicas, y en la actualidad las tres más importantes son las basadas en extrusión, impresión por gotas y láser. Este trabajo se enfoca en el desarrollo de una nueva técnica de bioimpresión láser para la impresión y aislamiento de célula única usando los conceptos base del Laser Induced Forward Transfer (LIFT). En el LIFT se usa la energía de un haz láser enfocado para transferir gotas de biomaterial hacia un objetivo. La técnica propuesta en este trabajo es una variación del LIFT llamado Blister Actuated LIFT (BA-LIFT), que usa una capa gruesa como interfaz protectora entre el haz láser y el biomaterial. Esta capa cumple la función de generar la fuerza motriz que permite la transferencia, así como ofrecer un medio de protección de la radiación y calentamiento proveniente del haz láser. Para el desarrollo de esta técnica la investigación se dividió en cinco fases. En la primera fase se desarrolla la primera aproximación de la técnica usando una capa interfaz hecha de un polímero semiconductor llamado P3HT. La razón principal de usar este polímero es por sus cualidades de absorber luz en el espectro visible, permitiendo así el uso de un láser que emita luz dentro de este rango espectral. La luz visible es potencialmente menos dañina para el material vivo, así que usar un láser visible podría ayudar a mejorar la viabilidad celular. A pesar de que fue demostrado que es posible transferir material biológico con el P3HT, varias complicaciones mostraron que no es la mejor aproximación. En la segunda fase de la investigación se propone un segundo polímero, una cinta adhesiva de poliimida. En esta fase se desarrollan todos los experimentos relacionados con la caracterización relevante de este material junto con la deposición del biomaterial. Los resultados mostraron que la poliimida es un excelente candidato para ser usado en el BA-LIFT ya que cumple con todas las características relativas a biocompatibilidad y deposición de capas líquidas. En cuanto a este último aspecto, se ve que es el parámetro más sensible del proceso. En la tercera fase se cubren los experimentos para probar la primera aproximación de impresión usando la poliimida. Aquí se usa un escáner galvanométrico para mover el haz láser a través del substrato que contiene el biomaterial. La impresión de patrones probó ser exitosa e incluso la impresión de célula única, sin embargo, para la aplicación principal propuesta que es la selección específica de una única célula no es la mejor aproximación. En la cuarta fase se presenta el equipo de laboratorio final donde el escáner es reemplazado por un objetivo de microscopio. Aprovechando el objetivo de microscopio, se instala un sistema de visualización coaxial al camino del haz láser permitiendo la visión, selección y transferencia de las células in situ. Además, un sistema de fluorescencia se instala junto con el de visión convencional permitiendo la visualización de células marcadas con fluorocromos. En la quinta y fase final de la investigación el equipo de laboratorio se usa como base para el diseño de una máquina que implementa todas las funciones desarrolladas durante la investigación. Este diseño se realizó conjuntamente con la empresa Innofluence, start-up generada en el propio grupo de investigación donde se desarrolló este trabajo, y permitió acabar este trabajo el desarrollo de aplicaciones más complejas. Las aplicaciones presentadas en esta fase son primero la selección y aislamiento de célula única usando biomarcadores, aislamiento de células “Natural Killer” para probar sus capacidades de activación post impresión, aislamiento de células madre hematopoyéticas y progenitoras para el estudio de formación de colonias y finalmente el aislamiento de células tumorales circulantes. Todas las aplicaciones resultaron exitosas, abriendo así una puerta para el uso de la técnica en otras aplicaciones que requieran la identificación y aislamiento de una única célula.