Tesis:
Estudio de los mecanismos de regulación de la germinación en Brasicáceas
- Autor: CALLEJA CABRERA, Julián
- Título: Estudio de los mecanismos de regulación de la germinación en Brasicáceas
- Fecha: 2023
- Materia: CONFIDENCIAL
- Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: https://oa.upm.es/74657/
- Director/a 1º: OÑATE SANCHEZ, Luis
- Director/a 2º: PERNAS OCHOA, Mónica
- Resumen: El primer paso crítico para la producción de cultivos, y que determina el éxito o el fracaso de la cosecha, es el establecimiento correcto de las plántulas tras la imbibición y germinación de las semillas. La germinación, definida como la emergencia de la radícula a través del endospermo y la testa, es un proceso controlado por la interacción entre el genotipo y las condiciones ambientales y regulado por el balance de dos hormonas con efectos antagónicos, el ácido abscísico (ABA) y las giberelinas (GAs). El conocimiento de los procesos básicos que regulan la germinación se ha obtenido, en gran medida, gracias al estudio de la planta modelo Arabidopsis, un pariente cercano de los cultivos de Brassica. Estos estudios han proporcionado una guía valiosa para interpretar y abordar el análisis de este proceso en especies cultivables con valor agronómico. Entre las condiciones ambientales que afectan al proceso de germinación, las altas temperaturas limitan la productividad de los cultivos, aunque los mecanismos reguladores de respuesta en semillas no son bien conocidos.
En trabajos previos realizados en el laboratorio, se describió una red génica esencial para la germinación de las semillas de Arabidopsis thaliana en respuesta a GAs. Dicha red está controlada por dos factores de transcripción (FT) con papeles antagónicos, RGL2, la principal proteína DELLA encargada de inhibir el proceso germinativo, y el FT NAC25, un regulador positivo de la expansión celular del endospermo y la germinación. A su vez, estos FTs controlan la expresión del gen EXPA2 (EXPANSINA 2) y otros genes que codifican enzimas de remodelación de la pared celular (CWREs) en el endospermo. Adicionalmente, en estos trabajos se obtuvieron evidencias preliminares de que dicha red podría integrar también la señalización por brasinoesteroides (BRs) mediante la participación del FT de tipo bHLH. Los resultados obtenidos en el desarrollo de esta tesis nos han permitido comprobar que este FT de tipo bHLH interacciona con RGL2 y NAC25 y regula la expresión de la EXPA2 a través de las secuencias E-box y G-box presentes en su promotor. Además, el análisis de mutantes de pérdida de función del gen confirmó que el FT de tipo bHLH es necesario para integrar la señalización mediada por BRs durante la germinación en Arabidopsis.
El segundo objetivo de esta tesis era establecer las características germinativas básicas de colza, Brassica napus, un cultivo de Brassica de gran interés agronómico. Para ello, se abordó el análisis en profundidad de 6 variedades de invierno de colza que muestran una gran variabilidad en el desarrollo del proceso germinativo. Los resultados indican que la velocidad de germinación es el principal componente que contribuye a esta variabilidad. El análisis comparativo entre estas variedades nos ha permitido determinar los procesos metabólicos y hormonales comunes entre ellas. Además, hemos identificado los niveles de malato y aspartato, así como el balance ABA/GAs como marcadores cruciales del rendimiento germinativo. También se demostró que las interacciones proteicas entre FTs claves en la germinación de Arabidopsis thaliana están conservados en B. napus. Finalmente, estudios transcriptómicos comparativos entre variedades con distintas dinámicas germinativas nos han permitido identificar varios genes y procesos biológicos cuya activación temprana podría ser responsable de las diferencias en germinación observadas.
Por último, se estudió el efecto de una temperatura más cálida en la germinación de las semillas de B. napus. Para ello, se utilizaron 12 variedades de primavera de colza que respondían de forma diferencial a este aumento de temperatura. El análisis de sus dinámicas de germinación nos ha permitido identificar los principales caracteres que contribuye a la variabilidad de respuesta al aumento de temperatura durante la germinación. Además, distintos estudios celulares del embrión de semillas de B. napus durante la germinación y en respuesta al aumento de temperatura, nos permitió determinar el escaso papel de la activación del meristemo radicular en la regulación de este proceso. Finalmente, llevamos a cabo un análisis transcriptómico comparativo entre dos variedades de colza que diferían en la respuesta al aumento de temperatura. Estos análisis nos han permitido obtener evidencias de que la aceleración de la germinación en respuesta a temperatura viene precedida por la activación precoz de genes de procesos reguladores clave en dicho proceso, así como la represión adelantada de genes relacionados con la maduración y la dormición de las semillas.
En conjunto, hemos descrito un módulo integrador de la señalización por GAs y BRs durante la germinación de Arabidopsis, así como identificado los procesos hormonales y metabólicos claves de la germinación de B. napus y el efecto de la temperatura sobre los mismos. Los conocimientos y datos generados en estas Tesis son de gran importancia para arrojar luz sobre el proceso de germinación en plantas de la familia de las Brasicáceas, y podrían ser utilizados para facilitar el estudio de la germinación en cultivos emparentados. Además, los genes claves identificados que regulan dicho proceso se podrían usar como posibles dianas para la mejora del rendimiento germinativo en estos cultivos.
ABSTRACT
The first critical step for crop production, which determines the success or failure of the harvest, is the correct establishment of seedlings after imbibition and germination of the seeds. The latter is defined as the emergence of the radicle through the endosperm and the testa. Germination is a process controlled by the interaction between the genotype and environmental conditions and regulated by the balance of two hormones with antagonistic effects, abscisic acid (ABA). and gibberellins (GAs). Knowledge of the basic processes that regulate germination has been obtained to a large extent from the study of the model plant Arabidopsis, a close relative of Brassica crops. These studies have provided a valuable guide to interpret and address the analysis of this process in cultivable species with agronomic value. Among the environmental conditions that affect the germination process, high temperatures are an important environmental factor that limits crop productivity. However, the regulatory mechanisms of the response to increased temperatures in seeds are not well known.
In previous work carried out in the laboratory, an essential gene network for the germination of Arabidopsis thaliana seeds in response to GAs was described. This network is controlled by two transcription factors (TFs) with antagonistic roles, RGL2, the main DELLA protein responsible for inhibiting the germinative process, and NAC25, a TF which promotes the germination process in response to GAs. In turn, these TFs control the expression of the EXPA2 gene (EXPANSIN 2) and other genes encoding cell wall remodeling enzymes (CWREs) in the endosperm. Additionally, preliminary evidence showed that this network could also integrate brassinosteroids (BRs) signaling through the participation of a bHLH-type TF. The results obtained during the development of this thesis have allowed us to verify that the bHLH-type TF interacts with RGL2 and NAC25 and regulates the expression of EXPA2 through the E-box and G-box sequences localized in its promoter. Furthermore, analysis of loss-of-function mutants confirmed that the bHLH-type TF is required to integrate BRs-mediated signaling during germination in Arabidopsis.
The second objective of this thesis was to establish the basic germinative characteristics of oilseed rape (Brassica napus), a Brassica crop of great agronomic importance. In this context, an in-depth analysis of 6 winter varieties of oilseed rape that show great variability in the development of the germination process was addressed. The results obtained in these analyzes indicate that germination speed is the main component that contributes to this variability. Moreover, the comparative analysis between these varieties has allowed us to determine the common metabolic and hormonal processes between them. In addition, we have identified that malate and aspartate levels, as well as the ABA/GAs balance are crucial markers of germination performance. We have also showed that the main protein interactions between key TFs in Arabidopsis thaliana germination are conserved in B. napus. Finally, comparative transcriptomic studies between varieties with different germination dynamics have allowed us to identify several genes and biological processes whose early activation could be responsible for the observed germination traits differences.
Finally, the effect of a warmer temperatures on the germination of B. napus seeds was studied. For this goal, 12 spring varieties of oilseed rape that responded differentially to warmer temperatures were used. The analysis of its germination dynamics has allowed us to identify the main traits that contributes to the variability of their response to an increase in temperature during germination. In addition, different cellular studies of the B. napus seed embryo during germination and in response to increased temperatures, have allowed us to determine the little role of root meristem activation in the regulation of this process. Finally, we carried out a comparative transcriptomic analysis between two oilseed rape varieties with different responses to warmer temperatures. These analyzes have allowed us to obtain evidence that the acceleration of germination in response to temperature is preceded by the early activation of genes related with key germination regulatory processes, as well as the earlier repression of genes related to maturation and dormancy of the seeds.
Taken together all these results, we have been able to describe an integrative module of GAs and BRs signaling during Arabidopsis germination together with the identification of key hormonal and metabolic processes of B. napus germination and the effect of temperature on them. The knowledge and data generated in this Thesis are of great importance to shed light on the germination process in plants of the Brassicaceae family and could be used to facilitate the study of germination in related crops. In addition, the key genes identified could be used as possible targets to improve germinative yield in these crops.