Tesis:
Determinants of virus seed transmission in Arabidopsis thaliana
- Autor: COBOS PIÑUELA, Alberto
- Título: Determinants of virus seed transmission in Arabidopsis thaliana
- Fecha: 2023
- Materia:
- Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: https://oa.upm.es/74013/
- Director/a 1º: PAGÁN MUÑOZ, Jesús Israel
- Resumen: La capacidad de transmisión es un factor clave para los patógenos, ya que en última instancia determina su eficacia biológica. Los virus de plantas no son una excepción y han evolucionado diversos mecanismos para garantizar su transmisión. La mejor caracterizada es la transmisión horizontal, de planta a planta, que se logra por contacto directo o por vectores. Si bien es muy importante para la epidemiología de la mayoría de los virus de plantas, la transmisión horizontal está lejos de ser su única forma de dispersión. La transmisión vertical, el paso del virus de una generación del huésped a la siguiente a través de semillas, forma parte del ciclo de vida de al menos una cuarta parte de los virus de plantas conocidos, y para algunas especies, como lo virus crípticos o persistentes, es la única forma de infectar a nuevos huéspedes. Este modo de transmisión es de gran importancia epidemiológica: permite a los virus de plantas sobrevivir dentro de la semilla mientras esta se mantenga viable y viajar grandes distancias sin la necesidad de vectores, dándoles la oportunidad de emerger en nuevas poblaciones de huéspedes donde pueden iniciar epidemias muy graves. Sin embargo, muchos aspectos del viaje del virus para llegar a los órganos reproductivos de la planta y de su vida dentro de las semillas siguen sin entenderse bien. Esta tesis tiene como objetivo mejorar la comprensión del proceso de transmisión por semilla de los virus de plantas centrándose en la interacción del virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV) y el virus del mosaico del nabo (Turnip mosaic virus, TuMV) con su huésped natural Arabidopsis thaliana.
Para invadir las semillas, los virus de plantas necesitan colonizar los tejidos reproductivos de la planta durante un intervalo de tiempo que es generalmente muy corto: mientras el embrión aún esté conectado a los tejidos maternos o durante la gametogénesis y antes de la fecundación. En base a esto, se analizaron diferencias en la cinética de las infecciones de CMV y TuMV, midiendo la velocidad a la cual el virus invade las estructuras reproductivas de la planta y el nivel de acumulación viral en dichas estructuras. Se analizó también el efecto de la infección sobre los pesos de la roseta e inflorescencia, y sobre la producción y supervivencia de las semillas. Todos estos factores se incluyeron en un análisis multivariante para estudiar su efecto conjunto sobre la eficacia en la transmisión por semilla de ambos virus en A. thaliana. El resultado de estos análisis indicó que los mejores predictores de la transmisión por semilla en ambos virus eran la multiplicación viral en la inflorescencia y la velocidad de movimiento del virus dentro de la planta.
Estudios epidemiológicos recientes indican que las infecciones virales mixtas son tanto o más frecuentes que las simples, tanto en ecosistemas silvestres como en agroecosistemas. Las interacciones que se establecen entre los virus pueden modular el proceso de infección, por ejemplo, alterando el nivel de multiplicación y la capacidad de colonización del huésped de los virus de plantas. Esto a su vez puede modificar la eficiencia de transmisión, incluyendo la de transmisión por semilla. Para estudiar estos efectos, se analizaron diferentes parámetros de la infección en situaciones de co- y super-infección de TuMV y CMV en A. thaliana, cuantificando su efecto sobre la multiplicación viral, virulencia y transmisión por semilla de ambos virus, que fueron posteriormente comparados con los resultantes en infecciones simples. Los resultados indicaron que las infecciones mixtas afectan a la multiplicación viral, virulencia y transmisión por semilla de ambos virus independientemente del tratamiento (co- o super-infección). El nivel de multiplicación de ambos virus en la roseta aumentó a consecuencia de la infección mixta, mientras que en la inflorescencia sólo lo hizo el de TuMV, a costa de reducirse la acumulación de CMV en esos tejidos. El incremento de la virulencia a causa de la infección mixta fue relativamente pequeño al compararlo con infecciones simples de TuMV, pero mucho más grande comparándolo con la virulencia mostrada por CMV en infección simple. Finalmente, aunque CMV mostró mayor transmisión por semilla que TuMV en infección simple, la infección mixta invirtió esta tendencia, incrementando la eficacia de transmisión por semilla de TuMV y reduciendo drásticamente la de CMV. Por tanto, una mayor trasmisión de TuMV en infecciones mixtas correlaciona con una mayor multiplicación en las estructuras reproductoras de la planta, indicando que los factores que controlan la transmisión por semilla en infecciones simples lo hacen también en las mixtas.
Usando los resultados anteriormente descritos como guía, se identificaron también los determinantes genéticos de la transmisión por semilla de CMV en A. thaliana. Mientras que la mayoría de los estudios previos están basados en análisis de loci de efecto cuantitativo (Quantitative Trait Loci, QTL), en esta tesis se ha usado un estudio de asociación del genoma completo (Genome-Wide Association Studies, GWAS), lo que ha permitido un análisis más preciso de los determinantes anteriormente mencionados. Con este objetivo, se estimó la transmisión por semilla de CMV en 165 genotipos de A. thaliana provenientes de la Península Ibérica. Este fenotipo sirvió como base para el GWAS que identificó 108 SNPs relacionados con la transmisión por semilla de CMV. Tras el proceso de anotado funcional, se centró el análisis en 25 genes candidatos, cuya función está relacionada con el control de la multiplicación viral y colonización del huésped, el desarrollo reproductivo del huésped y la formación de gametos y semillas. De estos 25, 10 genes contenían SNPs de efecto mayor. Otros 3 SNPs de efecto mayor se localizaron en genes que no pertenecían a las categorías anteriormente mencionadas, pero cuya función afectaba a procesos que podrían influir en la infección viral. Estos análisis suponen uno de los estudios más detallados de los determinantes de transmisión por semilla de virus de plantas que existen hasta la fecha.
Los determinantes genéticos de la transmisión por semilla no se encuentran sólo en el huésped, sino que también se encuentran en el genoma viral. Para identificar estos marcadores en el genoma de CMV, se mapearon los cambios a nivel de secuencia de nucleótidos de un genotipo de CMV después de su adaptación a la transmisión por semilla en A. thaliana. Se observó que la mayoría de los cambios se localizaban en los extremos 3’ no codificantes de los tres ARN genómicos del virus, con la excepción de un cambio no sinónimo en el marco abierto de lectura que codifica para la proteína 1a en el ARN1 de CMV. Dado que estas regiones genómicas están relacionadas con el proceso de multiplicación viral, que es determinante para la transmisión por semilla, se decidió estudiar el impacto estructural de las mutaciones identificadas. Los cambios nucleotídicos alteraron la estructura secundaria del extremo 3’ no codificante del ARN3 de CMV, así como la estructura tridimensional de la proteína 1a, codificada por el ARN1 del virus. Estos resultados sugieren que CMV se adapta a la trasmisión por semilla mediante cambios en regiones del genoma que afectan a la multiplicación viral.
En resumen, los resultados de esta tesis contribuyen a incrementar el conocimiento científico de un modo de trasmisión de virus de platas tan importante como poco conocido, y destacan que se trata de un proceso multifactorial determinado tanto por componentes genéticos del virus como del huésped.
ABSTRACT
Transmission capacity is a key factor for pathogens, as it ultimately determines their fitness. Plant viruses are no exception and have evolved varied mechanisms to ensure their transmission. The best characterized is the horizontal transmission, from plant to plant, which is achieved by direct contact or by vectors. Although very important for the epidemiology of most plant viruses, horizontal transmission is far from being their only way of spread. Vertical transmission, the passage of the virus from one host generation to the next via seeds, is part of the life cycle of at least a quarter of known plant viruses, and for some species, such as cryptic or persistent viruses, it is the only way to infect new hosts. This mode of transmission is of great epidemiological importance: it allows plant viruses to survive inside the seed as long as it remains viable and to travel long distances without the need for vectors, giving them the opportunity to emerge into new host populations where they can initiate damaging epidemics. However, many aspects of the virus's journey to reach the reproductive organs of the plant and of its life within the seeds remain poorly understood. This thesis aims to improve the understanding of the plant virus seed transmission process by focusing on the interaction of Cucumber mosaic virus (CMV) and Turnip mosaic virus (TuMV) with its natural host Arabidopsis thaliana.
To invade the seeds, plant viruses need to colonize the plant reproductive tissues during a time frame that is generally very short: while the embryo is still connected to the maternal tissues or during gametogenesis and before fertilization. Based on this, differences in the kinetics of CMV and TuMV infections were analyzed, measuring the speed at which the virus invades the reproductive structures of the plant and the level of viral accumulation in said structures. The effect of the infection on the rosette and inflorescence weights, and on the production and survival of the seeds was also analyzed. All these factors were included in a multivariate analysis to study their joint effect on the efficacy of seed transmission of both viruses in A. thaliana. The results of these analyses indicated that, for both viruses, the best predictors of seed transmission were viral multiplication in the inflorescence and their within-host speed of movement.
Recent epidemiological studies indicate that viral mixed infections are as frequent or more than single ones, both in wild- and agro-ecosystems. The interactions that are established between the viruses can modulate the infection process, for example, by altering the viral multiplication level and the colonization capacity of the host. This in turn can modify transmission efficiency, including that of seed transmission. To study these effects, different infection parameters were analyzed in situations of co- and super-infection of TuMV and CMV in A. thaliana, quantifying their effect on viral multiplication, virulence, and seed transmission of both viruses, which were subsequently compared to those resulting from single infections. The results indicated that mixed infections affect viral multiplication, virulence, and seed transmission of both viruses regardless of treatment (co- or super-infection). The multiplication level in the rosette increased for both viruses as a result of the mixed infection, while in the inflorescence only that of TuMV did, at the cost of reducing the accumulation of CMV in those tissues. The increase in virulence due to mixed infection was relatively small when compared to TuMV single infections, but much larger compared to the virulence shown by CMV single infections. Finally, although CMV showed greater seed transmission than TuMV in single infections, mixed infection reversed this trend, increasing the seed transmission efficiency of TuMV and drastically reducing that of CMV. Therefore, a greater transmission of TuMV in mixed infections correlates with a greater multiplication in the reproductive structures of the plant, indicating that the factors that control seed transmission in single infections do it so in mixed infections.
Using the results described above as a guide, the genetic determinants of CMV seed transmission in A. thaliana were also identified. While most previous studies are based on Quantitative Trait Loci (QTL) analysis, a Genome-Wide Association Study (GWAS) has been used in this thesis, which has allowed a more precise characterization of the previously mentioned determinants. With this objective, CMV seed transmission was estimated in 165 A. thaliana genotypes from the Iberian Peninsula. This phenotype served as the basis for the GWAS, which identified 108 SNPs related to CMV seed transmission. After the functional annotation process, the analysis was focused on 25 candidate genes, whose function is related to the control of viral multiplication and colonization of the host, the reproductive development of the host, and the formation of gametes and seeds. Of these 25, 10 genes contained major effect SNPs. Another 3 SNPs with a greater effect were located in genes that did not belong to the aforementioned categories, but whose function affected processes that could influence viral infection. These analyses represent one of the most detailed studies of the determinants of plant virus seed transmission that exist to date.
The genetic determinants of seed transmission are not only found in the host, but also in the viral genome. To identify these markers in the CMV genome, changes at the nucleotide sequence level of a CMV genotype after its adaptation to seed transmission in A. thaliana were mapped. Most of the changes were found to be located at the 3' non-coding ends of the three virus genomic RNAs, with the exception of one non-synonymous change in the open reading frame encoding protein 1a in CMV RNA1. Since these genomic regions are related to the viral multiplication process, which is determinant for seed transmission, it was decided to study the structural impact of the identified mutations. The nucleotide changes altered the secondary structure of the 3' non-coding end of CMV RNA3, as well as the threedimensional structure of protein 1a, encoded by the virus RNA1. These results suggest that CMV adapts to seed transmission through changes in genomic regions that affect viral replication.
In summary, the results of this thesis contribute to increasing scientific knowledge of a plant virus mode of transmission that is as important as it is little known, and highlight that it is a multifactorial process determined by both genetic components of the virus and the host.