Tesis:
Analysis of the adaptation of Rhizobium leguminosarum bv. viciae endosymbiotic phase to different hosts
- Autor: BALLESTEROS GUTIÉRREZ, Marta
- Título: Analysis of the adaptation of Rhizobium leguminosarum bv. viciae endosymbiotic phase to different hosts
- Fecha: 2023
- Materia:
- Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: https://oa.upm.es/76611/
- Director/a 1º: PALACIOS ALBERTI, Jose Manuel
- Director/a 2º: ALBAREDA CONTRERAS, Marta
- Resumen: Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) es una a-proteobacteria que induce nódulos radiculares fijadores de nitrógeno en asociación con Vicia, Pisum, Lens y Lathyrus. El análisis proteómico comparativo de bacteroides inducidos por la cepa Rlv UPM791 en plantas de lenteja y guisante mostró un número significativo de proteínas de expresión dependiente del hospedador. Una de estas proteínas (C189), sobreexpresada en bacteroides de guisante, está codificada en el plásmido simbiótico y muestra una gran similitud con una diaminobutirato-2-oxoglutarato aminotransferasa (DABA-AT). Esta enzima es dependiente de piridoxal-5-fosfato y cataliza la transferencia reversible del grupo amino del glutamato al L-aspartato-b-semialdehído (L-Asa), dando lugar a 2,4- diaminobutirato (DABA) y 2-oxoglutarato. Se han descrito DABA-ATs implicadas en varios procesos biológicos de bacterias endosimbióticas, incluyendo el metabolismo de la ectoína y la síntesis de sideróforos, poliaminas y pantotenato. Los objetivos de esta tesis son, por un lado, analizar el papel funcional y la expresión de C189 en vida libre y simbiosis, y por otro, determinar la relevancia ecológica del gen c189 en aislados de guisante y lenteja, y emplear esta colección bacteriana para seleccionar un inoculante efectivo para plantas de lenteja.
La actividad DABA-AT se demostró en extractos celulares de bacteroides y cultivos bacterianos, y en proteína purificada. La expresión de c189 se indujo en la zona central de nódulos de guisante, pero no de lenteja. En células vegetativas se detectaron niveles significativos de expresión, sugiriendo que la proteína C189 podría tener un papel fuera del nódulo.
El análisis de un mutante defectivo en c189 reveló que la proteína contribuye a la efectividad simbiótica y a la competitividad en simbiosis con guisante. La deleción del gen c189 no produjo alteraciones significativas en el perfil de poliaminas de células vegetativas ni de bacteroides. Un análisis comparativo del perfil metabolómico de bacteroides reveló que la deleción de c189 origina diferencias significativas en bacteroides de guisante, pero no en lenteja. Dicho análisis mostró que la mutación en c189 se asociaba a la ausencia de DABA en nódulos de guisante, lo que indica que la reacción DABA-AT podría dirigirse hacia la producción de DABA a partir de L-Asa. Este análisis también reveló la presencia de L-homoserina (L-Hse) en los bacteroides de guisante, y una reducción de los niveles de b-alanina (precursor del pantotenato) en los bacteroides del mutante c189 de guisante. El mutante mostró un crecimiento reducido en cultivos celulares con L-Hse como fuente de nitrógeno. Las cepas Rlv se han descrito como auxotrofas a pantotenato, pero la inclusión de DABA como fuente de nitrógeno en un medio mínimo con glucosa como fuente de carbono suprimió completamente esta auxotrofía, y en menor medida cuando L-Hse se incluyó como fuente de nitrógeno. No se observó auxotrofía para pantotenato con succinato como fuente de carbono lo que sugiere que los bacteroides podrían tener una ruta alternativa de síntesis de este compuesto. Estos datos indican que la enzima C189 de Rlv UPM791 podría formar parte de un mecanismo de adaptación de esta bacteria a un ambiente rico en L-Hse como es el nódulo y la rizosfera del guisante.
Con el fin de estudiar el posible papel ecológico de C189 en poblaciones rizobianas de suelo, se ha generado una colección de 213 aislamientos rizobianos (118 de lenteja y 96 de guisante) obtenidos de 2 suelos de Tierra de Campos (Valladolid). La diversidad rizobiana, estimada mediante análisis basados en RAPD y en el gen recA, fue similar en ambos suelos. El análisis de la presencia del gen c189 sugiere que no existe una selección positiva de este gen en las cepas obtenidas de guisante. El estudio del fenotipo simbiótico de los aislados de lenteja y de su competitividad por la nodulación ha permitido seleccionar cepas promisorias para la generación de inoculantes efectivos en lenteja.
ABSTRACT
Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) is an a-proteobacterium capable of inducing nitrogen-fixing root nodules in association with Vicia, Pisum, Lens and Lathyrus. Comparative proteomic analysis of bacteroids induced by Rlv UPM791 in lentil and pea plants showed a significant number of host-dependent expression proteins. One of these proteins (C189), overexpressed in pea bacteroids, is encoded on the symbiotic plasmid and shows a high similarity to a diaminobutyrate-2-oxoglutarate aminotransferase (DABA-AT). This enzyme is pyridoxal-5-phosphate dependent and catalyses the reversible transfer of the amino group from glutamate to L-aspartate-b- semialdehyde (L-Asa), resulting in 2,4-diaminobutyrate (DABA) and 2-oxoglutarate. DABA-ATs have been described to be involved in several biological processes in endosymbiotic bacteria, including ectoine metabolism and the synthesis of siderophores, polyamines and pantothenate. The aims of this thesis are, on the one hand, to analyse the functional role and the expression of C189 in free-living cells and symbiosis, and on the other hand, to determine the ecological relevance of the c189 gene in a collection of pea and lentil isolates, and also to use this collection to select an effective inoculant for lentil plants.
DABA-AT activity was demonstrated with bacteroid cell extracts and cultured cells, and also with purified protein. Expression of c189 was strongly induced in the central zone of pea but not lentil nodules. Low, but significant levels of expression were detected in vegetative cells, suggesting that the C189 protein may have a role outside the nodule.
Analysis of a c189-defective mutant revealed that the protein contributes to symbiotic effectiveness and competitiveness in symbiosis with pea but not with lentil plants. Deletion of the c189 gene did not produce significant alterations in the polyamine profile of vegetative cells or bacteroids. A comparative metabolomic profiling analysis revealed that deletion of c189 leads to significant differences in pea bacteroids, but not in lentil ones. This analysis revealed that the mutation in c189 was associated with the absence of DABA in pea nodules, sugesting that the DABA-AT reaction is directed towards DABA production from L-Asa. This analysis also showed the presence of Lhomoserine (L-Hse) in pea bacteroids, and reduced levels of b-alanine (precursor of pantothenate) in pea bacteroids of the c189 mutant. This mutant showed reduced growth in cell cultures with L-Hse as nitrogen source. Rlv strains have been described as auxotrophic to pantothenate, but inclusion of DABA as nitrogen source in minimal medium with glucose as carbon source completely suppressed this auxotrophy, and to a lesser extent when L-Hse was included as nitrogen source. No auxotrophy for pantothenate was observed with succinate as carbon source suggesting that bacteroids may induce an alternative route for synthesis of this compound. These data indicate that Rlv UPM791 C189 is part of an adaptation mechanism of this bacterium to a L-Hse-rich environment such as the pea nodule and rhizosphere.
In order to study the possible ecological role of C189 in soil rhizobial populations, a collection of 213 rhizobial isolates was generated (118 from lentil and 96 from pea) obtained from 2 soils of Tierra de Campos in Valladolid. Rhizobial diversity, estimated by RAPD and recA gene analysis, was similar in both soils. The analysis of the presence of the c189 gene in pea and lentil isolates suggests that there is no positive selection for this gene in pea isolates. The study of the symbiotic phenotype of lentil isolates and their competitiveness for nodulation under greenhouse conditions has allowed the selection of promising strains for the generation of effective inoculants in lentil.