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Tesis:

Role of type VI secretion systems of rhizobia in symbiosis with legumes and interbacterial competition

  • Autor: SILVA DE SOUSA, Bruna Fernanda

  • Título: Role of type VI secretion systems of rhizobia in symbiosis with legumes and interbacterial competition

  • Fecha: 2023

  • Materia:

  • Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS

  • Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL

  • Acceso electrónico: https://oa.upm.es/76718/

  • Director/a 1º: REY NAVARRO, Luis

  • Resumen: Los rizobios son bacterias de gran importancia agrícola y ecológica porque fijan nitrógeno en estructuras radiculares de leguminosas denominadas nodulos. Su interacción es muy específica y depende del intercambio de señales entre ellos y de la competitividad de los rizobios en la rizosfera. Las bacterias responden al medio ambiente y a otros organismos mediante secreción de proteínas implicadas en absorción de nutrientes, detección de señales ambientales, interacciones intercelulares, etc. La secreción se realiza por diferentes sistemas, como el sistema de secreción tipo VI (T6SS) que es una nanojeringa que inyecta proteínas efectoras tanto en células procariotas como eucariotas. Nuestro modelo de estudio es el T6SS de Rhizobium etli Mim1 (ReMim1) que nodula eficientemente judías. Trabajos previos demostraron que genes estructurales del T6SS eran necesarios para una simbiosis eficaz. En esta investigación, se estudiaron los genes no estructurales divididos en tres módulos. Se realizaron mutaciones en cada uno de los módulos y los mutantes no indujeron judías con menor peso seco en parte aérea, aunque produjeron un mayor número de nodulos que la cepa parental (wt). Estos resultados contrastan con los de un mutante en un gen estructural que mostró un menor número de nodulos y menor peso de parte aérea. Un análisis bioinformático mostró que el módulo 3 codifica cuatro proteínas de inmunidad, capaces de neutralizar efectores antibacterianos, y dos proteínas truncadas de función desconocida. El módulo 2 codifica una posible DNasa y su proteína de inmunidad que prevendría autointoxicación y un adaptador implicado en la secreción del efector. El módulo 1 codifica un nuevo par efector/proteína de inmunidad (E/I). El nuevo par E/1 está formado por Re78, una proteína cuya secreción depende del T6SS, y Re79, que presenta un péptido señal y se localiza en el periplasma. Re78 tuvo un efecto tóxico cuando se expresó con un péptido señal sintético en E. coli. Este efecto es neutralizado por Re79. Se identificaron homólogos a Re78 y Re79, principalmente en la familia Rhizobiaceae y en grupos de genes T6SS. El modelado de las estructuras e interacción de Re78 y Re79 identificó la superficie de contacto y aminoácidos clave. El mutante en los genes re78/79 fue menos competitivo en ensayos de coinoculación y en la ocupación de nodulos de judía en comparación con la cepa wt. No se encontró menor competitividad cuando se comparó con un mutante en un gen estructural. Esto demuestra que Re78, y por tanto el T6SS, proporcionan una ventaja en la competitividad bacteriana y en la ocupación de nodulos. Las fusiones transcripcionales de una región promotora del T6SS de ReMim1 mostraron actividad en nodulos de judía y en vida libre. Se observó una baja expresión de genes de los módulos 2 y 3 y algo más del módulo 1 en ambas condiciones mediante qPCR. La disminución de la expresión de las fusiones en un Rhizobium con deleción de los genes cinRIS, implicados en la regulación génica por Quorum Sensing, sugiere una regulación por este sistema, considerando que la expresión aumenta con la densidad óptica. Por último, se estudió el T6SS en sistemas multimicrobianos, se utilizaron dos comunidades sintéticas (SynCom) aisladas de la rizosfera de Arabidopsis thaliana (cepas At) y de la leguminosa Lotus japonicus (cepas Lj). Los microorganismos de cada SynCom pertenecen a las mismas familias. Dos cepas de Mesorhizobium, AtRoot695 y LjNodule218 tienen T6SS similares. LjNodule218 indujo nodulos en L japonicus de los que fue aislada, sin embargo, la inoculación de un mutante en el T6SS no indujo nodulos y este efecto se compensó cuando se inoculó con las otras cepas del SynCom-Lj La inoculación del SynCom-At con un mutante AtRoot695 en el T6SS produjo plantas más pequeñas frente al SynCom wt. Estos resultados muestran que los T6SS de rizobios desempeñan un papel en la competitividad de la rizosfera y en la simbiosis con los hospedadores estudiados. ABSTRACT Rhizobia are bacteria of great agricultural and ecological importance because they fix nitrogen in legume root structures called nodules. Their interaction is very specific and depends on signal exchange between them, and on the competitiveness of rhizobia in the rhizosphere. Bacteria can communicate with the environment and with other organisms by secreting proteins involved in nutrient uptake, sensing environmental signals, intercellular interactions, etc. Secretion can be done through different systems, one of which is the type VI secretion system (T6SS) which is a nanosyringe capable of injecting proteins called effectors into both prokaryotic or eukaryotic cells. Our model study is the T6SS of Rhizobium etli Mim1 (ReMim1) that efficiently nodulates beans. Previous work demonstrated that several structural genes of the T6SS were necessary for effective symbiosis. In this research non-structural genes were studied and divided into three modules. Mutations were made in each of the modules and the mutants did not induce beans with lower shoot dry weight, although they produced a higher number of nodules than the wild-type (wt) strain. These results contrast with a mutant in a structural gene that had previously shown lower nodule number and lower shoot weight. A bioinformatic analysis showed that module 3 encodes four so-called immunity proteins capable of neutralizing antibacterial effectors and two truncated proteins of unknown function. Module 2 contains an antibacterial effector with possible DNase function, and its immunity protein which may prevent autointoxication and an adaptor involved in the secretion of the effector. Module 1 encodes a novel effector/immunity protein (E/l) pair. The new E/l couple is formed by the Re78, a T6SS-dependent secreted protein, and Re79 which presents a signal peptide and is localized in the periplasm space. Re78 had a toxic effect when expressed with a synthetic signal peptide in E. coli. This effect is neutralized by Re79. Few proteins homologous to Re78 and Re79 were identified, mainly in the Rhizobiaceae family and in T6SS gene clusters. Modeling of the Re78 and Re79 structures and interaction identified the contact surface and key amino acids. The mutant with the re78/79 genes deleted was less competitive in co-inoculation assays and in the bean nodule occupation compared to the wt. No lower competitiveness was found when compared to a mutant in a T6SS structural gene. This demonstrates that the presence of Re78, and therefore T6SS, provides an advantage in bacterial competitiveness and nodule occupancy. Transcriptional fusions of a promoter region of ReMim1 T6SS showed activity in free-living and bean nodules. Low expression of genes from modules 2 and 3, and slightly more from module 1, was observed in both conditions by qPCR. Decreased expression of the promoters in a Rhizobium with a deletion of cinRIS genes, which are involved in gene regulation by Quorum Sensing, is suggestive of regulation by this system, especially since expression increases with optical density. Finally, a study of T6SS in multimicrobial systems was carried out using two synthetic communities (SynCom) isolated from the rhizosphere of Arabidopsis thaliana (At strains) and the legume Lotus japonicus (Lj strains). The microorganisms of each SynCom belong to the same families. Two Mesorhizobium strains, AtRoot695 and LjNodule218 have similar T6SS. LjNodule218 induced nodules in L japonicus from which it was isolated, however inoculation of a T6SS mutant did not induce nodules and this effect was compensated for when inoculated with the other SynCom-AtLj strains. Inoculation of SynCom-At with a AtRoot695 commensal strain T6SS mutant produced smaller plants than with SynCom wt. All these results show that rhizobia T6SS play a role in rhizosphere competitiveness and symbiosis with the studied plant hosts.