Tesis:
Desarrollo y aplicación de técnicas de caracterización mecánica celular basadas en deformación por contacto en dispositivos de microfluídica
- Autor: ABARCA ORTEGA, Aldo Fabián
- Título: Desarrollo y aplicación de técnicas de caracterización mecánica celular basadas en deformación por contacto en dispositivos de microfluídica
- Fecha: 2023
- Materia:
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS DE CAMINOS, CANALES Y PUERTOS
- Departamentos: CIENCIA DE LOS MATERIALES
- Acceso electrónico: https://oa.upm.es/77150/
- Director/a 1º: PLAZA BAONZA, Gustavo
- Resumen: Esta tesis doctoral se enmarca dentro del campo de la mecanobiología celular, centrándose en el desarrollo de tecnologías y técnicas de análisis del comportamiento celular mecánico. Las propiedades mecánicas de las células se han asociado a su funcionalidad biológica. Estas propiedades mecánicas se han identificado como biomarcadores del estado celular. Por ejemplo, los cambios en el citoesqueleto o en el núcleo celular que afectan a la rigidez celular están relacionados con cambios asociados a enfermedades o procesos de envejecimiento, proliferación, diferenciación y migración. El desarrollo de técnicas de alto rendimiento de caracterización mecánica celular ha progresado en la última década mediante el uso de dispositivos basados en los microfluidos, los que ofrecen una gran eficacia y fácil manipulación, por lo que representan importantes innovaciones en el campo de la mecanobiología. En particular, la técnica de citometría de deformación basada en constricciones resulta especialmente interesante, por permitir caracterizar el comportamiento mecánico de células para una variedad de rangos de tiempo y de deformaciones máximas alcanzadas. Sin embargo, hasta el momento de realización de esta tesis, los enfoques disponibles para esta técnica no permiten evaluar individualmente las propiedades mecánicas de una sola célula, y varios autores han informado de una gran variabilidad en las mediciones experimentales.
El objetivo principal de la tesis ha sido el desarrollo de una nueva metodología para la técnica de citometría de deformación basada en constricciones, para poder realizar medidas mecánicas de células individuales. Para ello, se ha tomado como técnica de referencia la aspiración con micropipeta. Con esta técnica se han realizado avances significativos en la automatización del análisis de experimentos de aspiración, mediante el desarrollo de un software basado en inteligencia artificial, logrando un alto rendimiento en el reconocimiento de células y la medición de su deformación. Además, empleando esta técnica y otras técnicas experimentales, se ha llevado a cabo un estudio transversal sobre el envejecimiento en células T CD4+ de memoria en ratones hembra. Se había observado en trabajos previos que la propiedades mecánicas y biofísicas celulares evolucionan con la edad de los individuos, perdiendo en promedio funcionalidad progresivamente para el conjunto de una población de ratones. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que las propiedades de las células T de individuos longevos son similares a las de individuos adultos jóvenes y sugieren que, de alguna forma, los ratones que alcanzan una longevidad excepcional logran mantener o recuperar estas propiedades en las células T.
Para el desarrollo de una nueva metodología de análisis para la técnica de citometría de deformabilidad basada en constricciones, la cual permita medir células individuales, ha sido necesario desarrollar protocolos experimentales y modelos mecánicos. Utilizando simulaciones computacionales se han estudiado factores clave que influyen en la deformación celular, como la presión diferencial en el dispositivo, su geometría y la de la célula. A partir de este estudio, en la tesis se propone un método de análisis heurístico basado en un modelo visco-hiperelástico cuasi-lineal. Esta técnica ha demostrado ser efectiva en la caracterización de propiedades viscoelásticas de células individuales, permitiendo obtener diferencias sutiles en su respuesta mecánica y aumentando notablemente las posibilidades de la técnica de citometría de deformación basada en constricciones.
ABSTRACT
This doctoral thesis is framed within the field of cell mechanobiology, focusing on the development of technologies and techniques for the analysis of mechanical cell behavior. The mechanical properties of cells have been associated with their biological functionality. These mechanical properties have been identified as biomarkers of cellular state. For example, changes in the cytoskeleton or in the cell nucleus that affect cell stiffness are related to changes associated with disease or aging processes, proliferation, differentiation and migration. The development of high-throughput cell mechanistic characterization techniques has progressed in the last decade through the use of microfluidic-based devices, which offer high efficiency and easy manipulation, thus representing important innovations in the field of mechanobiology. In particular, the constriction-based strain cytometry technique is particularly interesting, as it allows characterizing the mechanical behavior of cells for a variety of time ranges and maximum deformations reached. However, at the time of this thesis, the approaches available for this technique do not allow the mechanical properties of a single cell to be evaluated individually, and several authors have reported large variability in experimental measurements.
The main objective of the thesis has been the development of a new methodology for the microfluidic-based constriction deformability cytometry technique, in order to be able to perform single-cell mechanical measurements. For this purpose, micropipette aspiration has been used as a reference technique. With this technique, significant advances have been made in the automation of the analysis of aspiration experiments, through the development of software based on artificial intelligence, achieving high performance in the recognition of cells and the measurement of their deformation. In addition, using this technique and other experimental techniques, a cross-sectional study on aging in memory CD4+ T cells in female mice has been carried out. It had been observed in previous works that cellular mechanical and biophysical properties evolve with the age of the individuals, losing on average functionality progressively for the whole population of mice. The results obtained in this thesis show that the T cell properties of long-lived individuals are similar to those of young adult individuals and suggest that, somehow, mice that achieve exceptional longevity manage to maintain or recover these properties in T cells.
In order to develop a new analysis methodology for the constriction-based deformability cytometry technique to measure single cells, it has been necessary to develop experimental protocols and mechanistic models. Using computational simulations, key factors influencing cell deformation, such as differential pressure in the device, its geometry and the geometry of the cell, have been studied. From this study, a heuristic analysis method based on a quasi-linear visco-hyperelastic model is proposed in the thesis. This technique has proven to be effective in the characterization of viscoelastic properties of individual cells, allowing to obtain subtle differences in their mechanical response and increasing significantly the possibilities of the constriction-based deformability cytometry technique.