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Tesis:

Molecular and biological characterization of the mycovirome of botrytis cinerea and development of mycoviral reverse genetic systems

  • Autor: RUIZ PADILLA, Ana

  • Título: Molecular and biological characterization of the mycovirome of botrytis cinerea and development of mycoviral reverse genetic systems

  • Fecha: 2023

  • Materia:

  • Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS

  • Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL

  • Acceso electrónico: https://oa.upm.es/77161/

  • Director/a 1º: AYLLÓN TALAVERA, María Ángeles

  • Resumen: Botrytis cinerea es un hongo patógeno de plantas que causa podredumbre gris en más de 3000 especies de plantas, incluyendo más de 200 cultivos. Se encuentra ampliamente distribuido por todo el mundo y causa importantes pérdidas millonarias en cultivos como la vid, tomate, o pimiento, entre otros. Existen diversos factores que lo hacen uno de los principales hongos patógenos del mundo. En primer lugar, además de presentar una amplia gama de huéspedes, posee diversas formas de infección y supervivencia que incluyen esporas, micelio y esclerocios. Estas estructuras pueden infectar distintas partes de la planta en campo, y a los frutos en postcosecha. En segundo lugar, B. cinerea presenta una gran plasticidad genética que le permite generar resistencia a fungicidas en un tiempo corto. La principal medida de control de B. cinerea es la aplicación de fungicidas químicos, pero debemos encontrar alternativas más respetuosas con el medio ambiente, que eviten la generación de resistencias en el hongo, y que puedan ser usadas en estrategias de control integrado. En la búsqueda de soluciones alternativas más sostenibles el uso de micovirus se encuentra en pleno proceso de investigación. Los micovirus son virus que infectan a hongos de manera natural. A pesar de que la mayoría de micovirus no presentan ningún efecto en el fenotipo observable del hongo, existen cada vez más ejemplos de micovirus que son capaces de reducir la virulencia de los hongos en la planta. Esta tesis tiene como objetivo caracterizar el micoviroma del hongo B. cinerea en aislados de campo procedentes de vid, para así poder proponer nuevas vías de control biológico basadas en micovirus. En este trabajo se obtuvo una colección de aislados de campo de B. cinerea que se encontraron infectando racimos de uvas de viñedos de diferentes regiones de España (Jerez, La Rioja, Penedés y Ribera del Duero) y de Italia (Piemonte, Lombardia, Véneto, Basilicata y Sicilia). A partir de los aislados obtenidos, se llevó a cabo una caracterización biológica de los aislados de España para determinar su fenotipo y su virulencia, e identificar aislados hipovirulentos para, posteriormente, asociar la disminución de virulencia con la presencia de determinados micovirus. Los datos obtenidos muestran que algunos de los aislados son hipovirulentos, y que esa característica puede estar asociada con la presencia de micovirus. Por otra parte, se determinó el micoviroma de las colecciones de España e Italia mediante secuenciación masiva de ARN total (RNAseq). Los datos obtenidos de RNAseq fueron analizados mediante un pipeline bioinformático y se detectaron un total de 92 micovirus. Los micovirus identificados pertenecían a diversas familias de virus con genomas de ARN de simple cadena y sentido positivo (scARN(+)) y negativo (scARN(-)), de ARN de doble cadena (dcARN) y de ADN de cadena simple circular. Algunos de los virus identificados pertenecían a grupos que no habían sido asociados previamente a B. cinerea tales como narnavirus y micovirus tipo alfavirus, umbravirus y timovirus de scARN(+); virus bisegmentados y tetrasegmentados de dcARN; un virus trisegmentado de scARN (-) y un virus de DNA. Entre los resultados más relevantes obtenidos, se descubrieron los primeros micovirus trisegmentados relacionado filogenéticamente con los narnavirus, Botrytis cinerea binarnavirus 1, 2, 3 y 5 (BcBNV1, 2, 3, y 5), que tienen el gen que codifica para la RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp) dividido en dos segmentos; se identificó el primer virus trisegmentado tipo bunyavirus, Botrytis cinerea bocivirus 1, con segmentos genómicos monocistrónicos que codifican para una RdRp, una proteína de cápsida y una posible proteína de movimiento. Adicionalmente, se identificó el primer micovirus tetrasegmentado de simple cadena de ADN circular perteneciente a la familia Genomoviridae, Botrytis cinerea ssDNA virus 1 (BcssDV1). BcBNV2 y BcssDV1 han sido caracterizados molecularmente en detalle en esta tesis doctoral. Adicionalmente, se construyó un clon de cDNA basado en BcBNV2 para determinar los requerimientos del virus para replicar su genoma usando dos proteínas independientes que deben constituir una RdRp funcional. Esta parte no se ha completado con éxito debido a las dificultades asociadas a la construcción de un clon infecciosos basado en un virus multisegmentado. El desarrollo de sistemas genéticos reversos basados en micovirus es útil para realizar estudios de genómica funcional del hongo. Para ello se caracterizó molecularmente un virus previamente identificado infectando B. cinerea en distintas partes del mundo, Botrytis virus F (BVF), y se usó para construir un clon infeccioso. La construcción del clon infeccioso fue exitosa y permitió determinar la región promotora de la síntesis del RNA subgenómico para la traducción de su proteína de cápsida, y el efecto de la infección sobre el fenotipo de dos cepas del hongo, una cepa de laboratorio libre de virus, y una cepa de campo infectada con dos virus. El no efecto sobre el fenotipo del hongo, o la disminución de la virulencia de la cepa infectada con otros micovirus, le convierten en un candidato ideal para el desarrollo de un vector de expresión viral o de un vector de inducción de silenciamiento génico, para usarlo en biotecnología o en estrategias de control biológico. En resumen, los resultados de esta tesis han permitido expandir el conocimiento de la gran diversidad micoviral existente, de la transferencia horizontal de micovirus entre diferentes hongos, pero también de eventos de cruces de virus entre reinos, frecuentemente, hongos y plantas; y generar herramientas que puedan ser usadas en estrategias de control biológico y para el estudio de las interacciones entre micovirus, hongos y plantas. ABSTRACT Botrytis cinereais a plant pathogenic fungus that causes gray mold on more than 3000 plant species, including over 200 crops. It is widely distributed worldwide and causes significant economic losses in crops such as grapevine, tomato, and pepper, among others. Several factors contribute to its status as one of the world's leading fungal pathogens. Firstly, it has a wide range of hosts and various infection and survival methods, including spores, mycelium, and sclerotia. These structures can infect different parts of the plant pre-harvest and fruits post-harvest. Secondly, Botrytis cinereaexhibits great genetic plasticity, enabling it to develop resistance to fungicides in a short period. Chemical measures are the main control method for B. cinerea;however, we must seek more environmentally friendly alternatives that prevent the development of resistance in the fungus and can be employed in integrated pest management strategies. In the search for more sustainable alternatives, the use of mycoviruses is currently under investigation. Mycoviruses are viruses that naturally infect fungi. While most mycoviruses do not affect the observable phenotype of the fungus, there are increasing instances of mycoviruses capable of reducing the virulence of fungi in plants. This thesis aims to characterize the mycovirome of the fungus Botrytis cinereaisolated from grapevine. From these results, the goal is to propose new methods of biological control based on mycoviruses. In this study, we set a collection of B. cinereaisolates from infected grape bunches of vineyards from different regions of Spain (Jerez, La Rioja, Penedés y Ribera del Duero) and Italy (Piemonte, Lombardia, Veneto, Basilicata y Sicilia). Based on the obtained isolates, a biological characterization of the Spanish isolates was conducted to determine their phenotype and virulenceandidentify hypovirulent isolates in order to subsequently correlate the decrease in virulence with the presence of specific mycovirus. Resulted data showed some isolates were hypovirulent, which may be associated with the infection of mycoviruses. Additionally, the mycovirome of the Spanish and Italian collections was determined by high throughput sequencing total RNA (RNAseq). RNAseq data were analysedfollowing a bioinformatic pipeline, revealing a total of 92 mycoviruses. The identified mycoviruses belonged to diverse families of viruses with positive single-stranded RNA (ssRNA(+)) and negativesingle-strandedRNA (ssRNA(-)) genomes, double-stranded RNA (dsRNA) genomes, and single-stranded circular DNA genomes. Some of the identified viruses were from clades not previously associated with B. cinerea, such as narnaviruses and alpha-like, umbra-like, and tymo-like mycoviruses of ssRNA (+) genomes; bisegmented and tetrasegmented viruses of dsRNAgenomes; a trisegmented virus of ssRNA(-) and a DNA virus. Among the most relevant results obtained, the first trisegmented mycoviruses phylogenetically related to narnaviruses were discovered. These mycoviruses, Botrytis cinerea binarnavirus 1, 2, 3, and 5 (BcBNV1, 2, 3, and 5), have the gene encoding for RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) split into two segments. It was also identified the first trisegmented virus of the bunyavirus type, Botrytis cinerea bocivirus 1, which has monocistronic genomic segments encoding for an RdRp, a capsid protein, and a movement protein. Furthermore, it was described the first tetrasegmented mycovirus with a circular single-stranded DNA genome belonging to the Genomoviridaefamily, Botrytis cinerea ssDNA virus 1 (BcssDV1). BcBNV2 and BcssDV1 have been molecularly characterized in detail in this doctoral thesis. Additionally, acDNA clone based on BcBNV2was constructed to determine the virus's requirements for replicating its genome using two independent proteins that must constitute a functional RdRp. This part has notbeen successfully completed due to the difficulties associated with constructing an infectious clone based on a multisegmented virus. The development of reverse genetic systems based on mycoviruses is useful to conduct functional genomics studies of the fungus. To achieve this, a previously identified virus infecting B. cinereafrom different parts of the world, Botrytis virus F (BVF), was molecularly characterized and used to construct an infectious clone. The construction of the infectious clone was successful, allowing to determine the promoter region for the synthesis of subgenomic RNA for the translation of its capsid protein, and the effect of infection on the phenotype of two strains of the fungus: a virus-free laboratory strain and a field strain infected with two viruses. The absence of an effect on the fungal phenotype, or the reduction of virulence in the strain infected with other mycoviruses, makes it an ideal candidate for the development of a viral expression vector or a gene silencing induction vector, for its use in biotechnology or biological control strategies. In summary, the results of this thesis have expanded our knowledge of the extensive diversity of mycovirusesandhorizontal transfer of mycoviruses between different fungi, as well as cross-kingdom virus events, often involving fungi and plants. Moreover, this research has produced tools that can be utilized in biological control strategies and to study interactions among mycoviruses, fungi, and plants.