Tesis:
Probing Auxin Signaling Networks in a Dynamic Environment
- Autor: AVDOVIC, Merisa
- Título: Probing Auxin Signaling Networks in a Dynamic Environment
- Fecha: 2024
- Materia:
- Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: https://oa.upm.es/80458/
- Director/a 1º: WABNIK, Krzysztof
- Resumen: Over the past few decades, the genetic blueprints of many eukaryotic species have been unlocked, shedding light on RNA and protein synthesis pathways. However, the complexities of life extend beyond these genomic roadmaps. Central to this dynamic is the role of transcription factors (TFs), which convert genomic context into specific cellular responses. This thesis emphasizes the role of the Multiantibiotic resistance regulators (Mar) transcription factor family, particularly those sensitive to the phytohormones auxin and salicylic acid, in dictating such responses.
The research begins by demonstrating how Mar TFs can drive synchronized gene expression in yeast communities. Controlling synchronization in complex eukaryotic consortia on extended spatial-temporal scales remains a major challenge. Here, to address this issue we construct a minimal synthetic system that directly converts hormone signals into a coherent gene expression. Guided by Mar TFs, isolated colonies of yeast Saccharomyces cerevisiae oscillate in near-perfect synchrony despite the absence of intercellular coupling or intrinsic oscillations. Increased speed of chemical rhythms and incorporation of feedback in the system architecture can tune synchronization and precision of the cell responses in a growing cell collectives. The research here offers a potential for implementing similar strategies in more complex organisms, highlighting the adaptability of Mar TFs in various environmental contexts.
Moving forward, the research leverages the foundational principles of hormone- driven synchronization to control ion channel expression in yeast. Although the activity of ion channels can be locally regulated by external light or chemical stimulus, it remains challenging to coordinate the expression of ion channels on extended spatial– temporal scales. Here, we engineered S.cerevisiae to read and convert chemical concentrations into a dynamic potassium channel expression. A synthetic dual- feedback circuit controls the expression of engineered potassium channels through phytohormones auxin and salicylate to produce a macroscopically coordinated pulses of the plasma membrane potential. This part of my thesis not only highlights the broad applicability of Mar TFs in cellular physiology but also their potential in influencing larger-scale biological functions.
The focus then shifts to a deeper analysis of the IacR protein, an auxin sensor and part of the same Mar TFs family. Through examining various IacR variants from the “Acinetobacter” genus, we identified differences in their auxin sensitivity and DNA- binding capabilities, shedding light on the molecular diversity and evolutionary aspects of auxin perception. The experiments revealed diverse behaviors among the variants, with some showing stronger DNA binding and varied responses to auxin. Using a specialized microfluidic platform, we observed how these differences impact gene expression over time. This study enhances our understanding of auxin's role in plant growth and adaptation, opening up new possibilities for using these sensors in plant biology and biotechnology.
Finally, I utilized Mar TFs to control DNA binding affinity in natural auxin signalling circuits from plants. Our challenge was to understand auxin feedback signaling network, especially considering the many proteins involved in Arabidopsis. To tackle this, we transferred a key auxin-responsive circuit from plants into yeast, allowing us a clearer view without the interference of other plant components. Using microfluidic devices, we set up controlled and dynamic conditions. This helped us to observe various auxin-driven processes, from gene expression changes to protein breakdown, and shifts in the binding ability of auxin response factors to DNA by fusing Mar domain to Auxin response factors. Our findings provide valuable insights into how hormones regulate gene expression in plants and offer direction for future work in shaping plant growth, emphasizing the role of changing conditions in influencing these regulatory systems.
RESUMEN
Durante las últimas décadas, se han descifrado los programas genéticos de muchas especies eucariotas, arrojando luz sobre las vías de síntesis de ARN y proteínas. Sin embargo, la complejidad de la vida va más allá de estos mapas genómicos. El papel de los factores de transcripción (FT) es central en esta dinámica ya que convierten el contexto genómico en respuestas celulares específicas. Esta tesis enfatiza el papel de los factores de trasncripción de la familia de reguladores de resistencia a múltiples antibióticos (Mar), particularmente aquellos sensibles a las fitohormonas auxina y ácido salicílico, en dictar tales respuestas.
La investigación comienza demostrando cómo los FT tipo Mar pueden impulsar la expresión génica sincronizada en comunidades de levaduras. Controlar la sincronización en consorcios eucariotas complejos en escalas espaciotemporales extendidas sigue siendo un gran desafío. Aquí, para abordar este problema, construimos un sistema sintético mínimo que convierte directamente señales hormonales en una expresión génica coherente. Guiadas por los FT tipo Mar, colonias aisladas de la levadura Saccharomyces cerevisiae oscilan en sincronía casi perfecta a pesar de la ausencia de acoplamiento intercelular u oscilaciones intrínsecas. El aumento de la velocidad de los ritmos químicos y la incorporación de retroalimentación en la arquitectura del sistema pueden sintonizar la sincronización y precisión de las respuestas celulares en colectivos celulares en crecimiento. Nuestra investigación ofrece un potencial para implementar estrategias similares en organismos más complejos, destacando la adaptabilidad de los FT de la familia Mar en varios contextos ambientales.
Posteriormente, nuestra investigación aprovecha los principios fundamentales de la sincronización impulsada por hormonas para controlar la expresión de canales iónicos en levaduras. Aunque la actividad de los canales iónicos puede ser regulada localmente por estímulos de luz o químicos externos, sigue siendo un desafío coordinar la expresión de canales iónicos en escalas espaciotemporales extendidas en el tiempo. Aquí, manipulamos genéticamente S. cerevisiae para leer y convertir concentraciones químicas en una expresión dinámica de canales de potasio. Un circuito de retroalimentación dual sintético controla la expresión de canales de potasio ingenierados a través de fitohormonas auxina y salicilato para producir pulsos macroscópicamente coordinados del potencial de membrana plasmática. Esta parte de mi tesis no solo resalta la amplia aplicabilidad de los FT tipo Mar en la fisiología celular, sino también su potencial en influir en funciones biológicas a mayor escala.
El enfoque después se traslada a un análisis más profundo de la proteína IacR, un sensor de auxina y parte de la misma familia de FT del la familia Mar. Al examinar varias variantes de IacR del género "Acinetobacter", identificamos diferencias en su sensibilidad a la auxina y en su capacidad de unión al ADN, arrojando luz sobre la diversidad molecular y aspectos evolutivos de la percepción de auxinas. Los experimentos revelaron comportamientos diversos entre las variantes, con algunos mostrando una unión más fuerte al ADN y respuestas variadas a la auxina. Usando una plataforma de microfluidos especializada, observamos cómo estas diferencias impactan en la expresión génica a lo largo del tiempo. Este estudio mejora nuestra comprensión del papel de la auxina en el crecimiento y adaptación de las plantas, abriendo nuevas posibilidades para usar estos sensores en biología vegetal y biotecnología.
Finalmente, utilicé los FT de la familia Mar para controlar la afinidad de unión al ADN en circuitos de señalización natural de auxina en plantas. Nuestro desafío fue comprender la red de señalización de retroalimentación de auxina, especialmente considerando las numerosas proteínas involucradas en Arabidopsis. Para abordar esto, trasladamos un circuito clave sensible a la auxina de las plantas a levaduras, lo que nos permitió una visión más clara sin la interferencia de otros componentes vegetales. Utilizando dispositivos microfluídicos, establecimos condiciones controladas y dinámicas. Esto nos ayudó a observar varios procesos impulsados por la auxina, desde cambios en la expresión génica hasta la degradación de proteínas, y cambios en la capacidad de unión de los factores de respuesta a la auxina al ADN al fusionar el dominio Mar con los factores de respuesta a la auxina. Nuestros hallazgos proporcionan valiosas perspectivas sobre cómo las hormonas regulan la expresión génica en las plantas y ofrecen orientación para trabajos futuros en la regulación del crecimiento vegetal, enfatizando el papel de las condiciones cambiantes en la influencia de estos sistemas reguladores.