Autor: REINOSO PELÁEZ, Edgar Leonardo
Título: Study of the metagenome of the genital tract in sheep and its role in reproductive efficiency
Fecha: 2025
Materia: ---
Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
Departamento: SIN DEPARTAMENTO DEFINIDO
Acceso electrónico: https://oa.upm.es/90909/
Director/a(s):
- Director/a: SERRANO NOREÑA, Magdalena
- Director/a: SAURA ÁLVAREZ, María
Resumen: Sheep farming plays a critical role in global agriculture, particularly in Mediterranean countries such as Spain. Despite advances in genetic selection and reproductive technologies, fertility rates following artificial insemination (AI) remain suboptimal, primarily due to anatomical and physiological constraints. Increasing evidence points to the reproductive tract microbiota as a potential modulator of fertility. However, its composition, functional relevance, and interaction with host genetics remain insufficiently characterised in ovine species. In this context, this thesis investigates the relationship between vaginal microbiota and reproductive success in sheep, focusing on AI outcomes through four complementary studies. Study 1 characterised bacterial communities via 16S rRNA metabarcoding to establish a reference microbiota and assess its association with pregnancy. Study 2 expanded this analysis using Oxford Nanopore Technologies (ONT) based metagenomics to capture broader microbial diversity, including functional pathways. Study 3 examined the impact of oestrus synchronisation devices (PRID) and treatments on vaginal microbiota and AI success. Study 4 employed Microbiota Genome-Wide Association Studies (MGWAS) to explore host genetic factors influencing microbial composition. The work involved multiparous ewes from four Spanish breeds (Latxa, Manchega, Rasa Aragonesa, and Assaf). Vaginal swabs were collected prior to AI and analysed using advanced sequencing techniques, including 16S rRNA metabarcoding and ONT-based metagenomics. Specific bioinformatic tools enabled microbial classification and functional profiling. To explore host genetic influences on microbiota, ewes were genotyped using a high-density SNP chip. Classical statistical inference and machine learning techniques were used to assess microbial diversity, identify differentially abundant taxa, evaluate predictive associations, and explore the hostmicrobiota interactions associated to fertility. A consistent core microbiota was identified, dominated by the genera Streptobacillus, Histophilus, Fusobacterium, Oceanivirga, and Parvimonas. Herd and breed were important drivers of microbial variation, suggesting that environmental and host genetic factors shape microbiome composition and abundance. PRID devices and associated antibiotic treatments significantly modified composition, reducing potentially harmful taxa. Pregnancy status showed moderate association with vaginal microbiota composition. Taxa were differentially abundant between pregnant and non-pregnant ewes. Fusobacterium, Histophilus, Leptotrichia, Campylobacter, and Treponema were enriched in non-pregnant ewes, along with functional pathways related to inflammation and metabolism. In contrast, pregnant ewes more frequently harboured Pseudomonas, Acinetobacter, Brevundimonas, and Glutamicibacter, suggesting a microbial environment more conducive to successful reproduction. MGWAS identified host genetic variants associated with microbial genera known to influence fertility. Variants in genes linked to immune regulation, epithelial integrity, and metabolism influenced microbial composition. SNPs associated with beneficial genera such as Lactobacillus and Bifidobacterium breve were predicted to enhance mucosal immune tolerance and nutrient availability, while alleles linked to potentially pathogenic genera such as Actinobacillus, Gardnerella, and Fusobacterium nucleatum suggested compromised host defence mechanisms. In conclusion, this thesis provides an integrative perspective on vaginal microbiota and its relationship to sheep reproductive outcomes. Microbiota structure was considerably shaped by herd, breed, and PRID treatments, while specific microbial taxa and functions were associated with pregnancy outcomes. Moreover, host genomic variation contributed to microbial composition, underscoring the potential of combining microbial and genetic analyses to enhance reproductive efficiency in sheep. RESUMEN La producción ovina desempeña un rol clave en la agricultura global, especialmente en países mediterráneos como España. A pesar de los avances en mejora genética y tecnologías reproductivas, la tasa de fertilidad tras la inseminación artificial (IA) en ovejas sigue siendo subóptima por limitaciones anatómicas y fisiológicas. Estudios recientes sugieren que la microbiota del tracto reproductivo podría modular la fertilidad; sin embargo, su composición, función e interacción con el hospedador está poco caracterizada. Esta tesis investiga la relación entre la microbiota vaginal y el éxito reproductivo por IA en ovejas mediante cuatro estudios. El Estudio 1 caracterizó la microbiota mediante secuenciación parcial del gen del ARNr 16S, estableciendo una microbiota de referencia y evaluando su asociación con la tasa de preñez. El Estudio 2 amplió este análisis utilizando metagenómica basada en secuenciación por nanoporos, lo que permitió analizar genes y funciones microbianas. El Estudio 3 evaluó el impacto de los dispositivos de sincronización del estro (PRID) y tratamientos asociados sobre la microbiota. El Estudio 4 investigó la influencia genética del hospedador sobre la abundancia de la microbiota mediante estudios de asociación de genoma completo (MGWAS). Se recogieron muestras de exudado vaginal antes de la IA en ovejas multíparas de cuatro razas españolas, Latxa, Manchega, Rasa Aragonesa y Assaf, y se secuenció el ADN mediante metabarcoding del ARNr 16S y metagenómica por nanoporos. La caracterización taxonómica y funcional se realizó con herramientas bioinformáticas específicas. Para explorar la influencia de la genética del hospedador sobre la microbiota, las ovejas se genotiparon con un chip de SNPs de alta densidad. Se aplicaron métodos clásicos de inferencia estadística y de aprendizaje automático para evaluar la diversidad microbiana, identificar taxones diferencialmente abundantes, y explorar la interacción hospedador-microbiota y su relación con la preñez. Se identificó una microbiota de referencia dominada por Streptobacillus, Histophilus, Fusobacterium, Oceanivirga y Parvimonas. El rebaño, la raza, y el uso de PRID influyeron notablemente en la composición y abundancia de la microbiota, resaltando la importancia de factores ambientales y genéticos. El uso del tratamiento antibiótico asociado al PRID contribuyó a reducir la presencia de taxones potencialmente perjudiciales. La preñez mostró una asociación moderada con la microbiota vaginal. Fusobacterium, Histophilus, Leptotrichia, Campylobacter y Treponema, fueron más abundantes en ovejas no preñadas, y se asociaron con rutas relacionadas con inflamación y metabolismo. Por el contrario, Pseudomonas, Acinetobacter, Brevundimonas y Glutamicibacter fueron más comunes en ovejas gestantes, asociándose a un entorno reproductivo más favorable. El MGWAS identificó variantes genéticas del hospedador asociadas a la abundancia de taxones vinculados a la fertilidad. Estas variantes están relacionadas con la inmunidad, integridad epitelial y metabolismo. Variantes vinculadas a Lactobacillus y Bifidobacterium breve se asociaron a una mucosa vaginal más tolerante y a una mayor eficiencia del hospedador para suministrar nutrientes. Mientras que variantes relacionadas con mayor abundancia de Actinobacillus, Gardnerella y Fusobacterium nucleatum sugirieron un efecto de debilitamiento en los mecanismos de defensa del hospedador. En conclusión, esta tesis ofrece una visión integradora de la microbiota vaginal ovina y su vínculo con la reproducción. La composición microbiana estuvo considerablemente determinada por el rebaño, la raza y el uso de PRID. Aunque la asociación con la preñez fue menos marcada, se identificaron taxones y funciones específicos significativamente relacionados. La variación genética del hospedador también influyó en la composición microbiana, destacando el potencial de integrar perfiles microbianos y genéticos para mejorar el rendimiento reproductivo.