Autor: SOLDEK, Joanna Natalia
Título: Functional analysis of a host-dependent metal transporter system in the Rhizobium-legume symbiosis
Fecha: 2025
Materia: ---
Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
Departamento: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
Acceso electrónico: https://oa.upm.es/91836/
Director/a(s):
- Director/a: ALBAREDA CONTRERAS, Marta
Resumen: Nitrogen-fixing Rhizobium-legume symbiosis provides agricultural systems with a sustainable and environmentally friendly source of nitrogen alternative to the use of fertilisers. The establishment of an effective symbiosis requires the adjustment of the behaviour of both partners through a sophisticated plant- and bacteria-dependent molecular mechanisms, which lead to the formation of root nodules where rhizobia are differentiated into bacteroids, the nitrogen-fixing form. Bacteroids are fully dependent on plant cells for the acquisition of nutrients. In this context, the establishment of the symbiosis triggers metal uptake mechanisms in the bacteroid, as many rhizobial metalloenzymes are essential for bacteroid functions and symbiotic performance. A previous proteomic analysis showed the existence of a relevant number of proteins differentially expressed in bacteroids induced by Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) UPM791 in pea and lentil nodules. These results suggest that each host provides a different environment in the nodule that induces specific responses in the bacteria that might be essential to obtain an effective symbiosis. Among these proteins, a metal-binding protein (RLV_3444) component of an ABC-transporter system (RLV_3442-3444) was shown to be overexpressed in pea bacteroids, suggesting that metal provision to the bacteroid is more restrictive in the Rhizobium-pea symbiosis. In this Thesis, the function and expression of the RLV_3442-3444 transporter system have been analysed under both free-living and symbiotic conditions. In addition, the in vitro metal-binding properties of the host-dependent protein RLV_3444 have been investigated, providing insights into its metal-binding specificity. Protein sequence analysis and structural modelling revealed that RLV_3444 is highly similar to the functionally characterised zinc-binding protein ZniA from Klebsiella pneumoniae, so the host-dependent metal-binding protein was renamed ZniA, and the transporter system was designated as ZniCBA. The genome of Rlv UPM791 also encodes the conserved high-affinity zinc transporter system ZnuABC. Functional analysis has demonstrated that at least one of the two systems must be present for Rlv to grow under zinc-limited conditions and for optimal symbiotic performance with pea and lentil plants. In addition, the three conserved histidines present in multiple Zn2+-binding proteins have been shown as essential for the function of Rlv ZniA, and in silico modelling suggests that they might participate in metal coordination. Gene expression analysis indicated that both ZniCBA and ZnuA are regulated by zinc in a transcriptional regulator Zur-dependent manner, consistent with the presence of a Zur box in their regulatory region. The expression patterns revealed that ZniCBA is expressed at lower levels than ZnuA, and its expression increased in a znuA mutant in both free-living and symbiotic conditions. Purified Rlv ZniA was shown to bind both Zn2+ and Mn2+, but with a higher affinity for zinc and likely in a 1:1 molar ratio. However, the results derived from the functional and expression analyses of ZniCBA, together with the finding that the recombinant protein contained only zinc, strongly suggest that zinc is the physiologically relevant substrate of ZniA. Altogether, these results, along with the increment in the expression of ZniCBA in pea vs. lentil bacteroids, suggest that ZniCBA might play an auxiliary function for zinc uptake under zinc-starvation conditions and might play a relevant role in the adaptation of Rlv to its legume host. RESUMEN La simbiosis fijadora de nitrógeno Rhizobium-leguminosa proporciona a los sistemas agrícolas una fuente sostenible de nitrógeno alternativa al uso de fertilizantes y respetuosa con el medio ambiente. El establecimiento de una simbiosis efectiva requiere el ajuste de ambos simbiontes mediante sofisticados mecanismos moleculares dependientes tanto de la planta como de la bacteria, que conducen a la formación de nódulos radiculares donde los rizobios se diferencian a bacteroides, las formas fijadoras de nitrógeno. Los bacteroides dependen completamente de la adquisición de nutrientes por parte de la célula vegetal. En este contexto, el establecimiento de la simbiosis activa mecanismos de captación de metales en el bacteroide, dado que numerosas metaloenzimas rizobianas son esenciales para las funciones del bacteroide y el rendimiento simbiótico. Un análisis proteómico mostró la existencia de un número relevante de proteínas que se expresan de forma diferencial en bacteroides inducidos por la cepa UPM791 de Rhizobium leguminosarum bv. viciae (Rlv) en nódulos de plantas de guisante y lenteja. Estos resultados sugieren que cada hospedador provee un ambiente diferente en el nódulo que induce en las bacterias respuestas específicas que serían esenciales para obtener una simbiosis efectiva. Entre estas proteínas, se identificó una proteína de unión a metal (RLV_3444), componente de un sistema transportador ABC (RLV_3442-3444), de sobreexpresión en bacteroides de guisante, sugiriendo que la provisión de metales es más restrictiva en la simbiosis Rhizobium-guisante. En esta Tesis se ha realizado un análisis funcional y de expresión del sistema transportador RLV_3442-3444 en condiciones de vida libre y en simbiosis. Además, se han investigado las propiedades de unión a metal de la proteína RLV_3444 dependiente de hospedador, lo que ha permitido determinar su especificidad de unión metal. El análisis de la secuencia aminoacídica y el modelado estructural revelaron que RLV_3444 es altamente similar a la proteína ZniA de Klebsiella pneumoniae, caracterizada funcionalmente como una proteína de unión a zinc. Por ello, RLV_3444 fue renombrada como ZniA, y el sistema transportador designado como ZniCBA. El genoma de Rlv UPM791 también codifica para el sistema transportador conservado y de alta afinidad ZnuABC. El análisis funcional ha demostrado que al menos uno de los dos sistemas transportadores debe estar presente para que Rlv crezca en condiciones limitantes de zinc y para un rendimiento simbiótico óptimo con plantas de guisante y lenteja. Además, tres residuos de histidina de Rlv ZniA, conservados y presentes en un gran número de proteínas de unión a Zn2+, han resultado ser esenciales para la función de la proteína, y el análisis del modelado in silico sugiere que podrían participar en la coordinación del metal. Los análisis de expresión génica indicaron que tanto zniCBA como znuA están regulados por zinc de forma dependiente del regulador transcripcional Zur, de forma consistente con la presencia de una caja Zur en sus regiones regulatorias. Los patrones de expresión revelaron que ZniCBA se expresa a niveles menores que ZnuA, pero su expresión aumenta en un mutante znuA tanto en condiciones de vida libre como en simbiosis. Se ha demostrado que la proteína purificada Rlv ZniA se une tanto a Zn2+ como a Mn2+, pero con una mayor afinidad por zinc, y probablemente en una relación molar 1:1. Los resultados derivados del análisis funcional y de expresión de ZniCBA, junto con la observación de que la proteína recombinante únicamente contenía zinc, evidencian que el zinc es el sustrato fisiológico relevante de ZniA. En conjunto, estos resultados, junto con el incremento de la expresión de ZniCBA en bacteroides de guisante vs. lenteja, sugieren que ZniCBA podría jugar una función auxiliar en la captación de zinc bajo condiciones de deficiencia de este metal y podría desempeñar un papel relevante en la adaptación de Rlv a su leguminosa hospedadora.