Autor: ZAHIA INSSAF, Nedjari
Título: Investigations on the plasticity of epistasis among mutations in bacteria
Fecha: 2025
Materia: ---
Escuela: E.T.S. DE INGENIERÍA AGRONÓMICA, ALIMENTARIA Y DE BIOSISTEMAS
Departamento: SIN DEPARTAMENTO DEFINIDO
Acceso electrónico: https://oa.upm.es/92037/
Director/a(s):
- Director/a: COUCE IGLESIAS, Alejandro
- Director/a: DABOS, Laura
Resumen: The evolution of antibiotic resistance is shaped not only by individual mutations but also by their interactions a phenomenon known as epistasis. These interactions can profoundly alter evolutionary outcomes by changing the fitness effect of a mutation depending on its genetic context. This framework is captured by the concept of adaptive landscapes, which map genotypes to fitness and determine which mutational trajectories are accessible to evolution. However, the plasticity of these landscapes how their shape changes across environments or hosts remains poorly understood. In this thesis, we addressed this question using a clinically important -lactamase, KPC-2, responsible for carbapenem resistance in many pathogenic bacteria. We first used directed evolution to explore the mutational paths by which KPC-2 can improve its activity against ceftazidime (CAZ)an initially poor but clinically relevant substrate. From this, we identified the six most frequent resistance-enhancing mutations and engineered all 64 possible combinations to construct a complete combinatorial library. We used minimum inhibitory concentrations as a proxy for fitness to characterize the emerging landscape not only under ceftazidime pressure, but also across a range of alternative environments and bacterial hosts. In Escherichia coli, the adaptive landscape under ceftazidime pressure exhibited a single resistance peak, achieved by combining just two mutations. Most combinations of mutations were neutral or deleterious, indicating pervasive negative and sign epistasis. Resistance increased steeply at first but quickly plateaued in a lineage-specific manner. These plateaus were not evolutionary dead ends, as further mutations accumulated to compensate for losses in stability and fitness. Divergent mutational paths rapidly generated cryptic phenotypic diversityaffecting traits like collateral resistance, enzyme activity, and drug-free fitnesslikely influencing the long-term success of KPC-2 variants across hosts and environments. To assess the plasticity of this landscape, we tested the same mutant library across seven alternative environments, including elevated temperature, the presence of a -lactamase inhibitor, and other -lactams varying in chemical similarity to ceftazidime. While the global shape of the landscape shifted across environmentsrevealing pervasive negative and sign epistasiskey mutations retained consistently large effect sizes, regardless of their sign. Only two genotypes acted as condition-independent generalists; the rest were specialists adapted to either CAZ or non-CAZ conditions. Notably, the generalists were often inaccessible through strictly beneficial mutational steps, making them unreachable by selection in about half the environments. We explored how the same landscape behaves in different bacterial hosts. The mutant library was transferred into Klebsiella oxytoca and Proteus mirabilis, species with distinct GC contents. Transferring the library to these hosts flattened the landscape and eliminated the CAZ resistance peak. The host-specific resistance profiles are consistent with reduced periplasmic accumulation of KPC-2, pointing to bottlenecks in translation, secretion, folding, or stabilityrather than differences in gene dosage or expression. Altogether, this work provides empirical evidence that epistasis is highly context-dependent, and that adaptive landscapes are plastic, shaped by both environmental factors and host-specific constraints. These findings underscore the importance of integrating genetic, environmental, and physiological dimensions when studying the evolution of antibiotic resistance. RESUMEN La evolución de la resistencia a los antibióticos está determinada no solo por mutaciones individuales, sino también por sus interacciones, un fenómeno conocido como epistasis. Estas interacciones pueden alterar profundamente los resultados evolutivos al modificar el efecto de una mutación según su contexto genético. Este marco se describe mediante los llamados paisajes adaptativos, que vinculan genotipos con niveles de fitness y definen qué trayectorias mutacionales están disponibles para la evolución. Sin embargo, la plasticidad de estos paisajes es decir, cómo cambia su forma en distintos entornos u hospedadores sigue siendo poco comprendida. En esta tesis, abordamos esta cuestión utilizando una -lactamasa clínicamente relevante, KPC-2, responsable de la resistencia a carbapenemes en muchas bacterias patógenas. En primer lugar, empleamos evolución dirigida para explorar las trayectorias por las cuales KPC-2 puede mejorar su actividad frente a ceftazidima (CAZ), un sustrato inicialmente poco eficiente pero clínicamente importante. A partir de estos experimentos, identificamos las seis mutaciones más frecuentes que aumentan la resistencia y generamos las 64 combinaciones posibles entre ellas para construir una biblioteca combinatoria completa. Usamos las concentraciones mínimas inhibitorias (MICs) como indicador indirecto de fitness para caracterizar el paisaje emergente no solo bajo presión de ceftazidima, sino también en una variedad de entornos alternativos y hospedadores bacterianos. En Escherichia coli, el paisaje adaptativo bajo presión de ceftazidima mostró un único pico de resistencia, alcanzado mediante solo dos mutaciones. La mayoría de las combinaciones resultaron neutras o deletéreas, lo que indica que epistasis negativa y de signo son generalizadas. En general, la resistencia a ceftazidima mostró un rápido aumento inicial, llegando a un plateau en dos o tres mutaciones. Sin embargo, la altura y velocidad con que se llega a esos plateaus es altamente dependiente del linaje. Estos plateaus, además, no supusieron stasis evolutiva, ya que documentamos la acumulación de mutaciones que compensan las pérdidas de estabilidad y los costes colaterales en aptitud introducidos por las mutaciones iniciales. Finalmente, las trayectorias divergentes generaron diversidad fenotípica críptica, afectando características como la resistencia cruzada a otros antibióticos, la actividad enzimática, la estabilidad y el coste en aptitud sin antibiótico, lo que probablemente influya en el éxito a largo plazo de variantes de KPC-2 en su viaje a través de distintos hospedadores y ambientes. Para evaluar la plasticidad del paisaje, analizamos la misma biblioteca de mutantes en siete entornos alternativos, incluyendo temperatura elevada, presencia de un inhibidor de -lactamasas y otros -lactámicos. Aunque la forma global del paisaje varió entre condicionesrevelando epistasis negativa y por cambio de signo en todos los casos, algunas mutaciones clave mantuvieron consistentemente efectos de gran magnitud, independientemente de su signo. De entre el total de 64 alelos, solo dos genotipos presentaron un perfil generalista, incrementando resistencia en casi todos los ambientes. El resto, en su mayor parte, mostraron perfiles de especialista adaptados ya sea a condiciones con o sin CAZ. De forma notable, observamos que los genotipos generalistas son a menudo inaccesibles mediante pasos mutacionales estrictamente beneficiosos, lo que los vuleve inalcanzables por selección natural en aproximadamente la mitad de las condiciones. Por último, también exploramos cómo se comporta este paisaje en diferentes hospedadores bacterianos. La biblioteca de mutantes fue transferida a Klebsiella oxytoca y Proteus mirabilis, especies con distintos contenidos de GC. La transferencia a estos hospedadores aplanó el paisaje adaptativo y eliminó el pico de resistencia a CAZ. Los perfiles de resistencia específicos de cada hospedador fueron compatibles con una menor acumulación periplásmica de KPC-2, lo que sugiere un cuello de botella en traducción, secreción, plegamiento o estabilidad, más que diferencias en expresión génica o número de copias. En conjunto, este trabajo aporta evidencia empírica de que la epistasis es altamente dependiente del contexto, y que los paisajes adaptativos son plásticos, moldeados tanto por factores ambientales como por las particularidades del hospedador. Estos resultados subrayan la importancia de integrar dimensiones genéticas, ambientales y fisiológicas al estudiar la evolución de la resistencia a los antibióticos.