Autor: TABRAUE RUBIO, Raquel
Título: Estrategias para la inmovilización de células en sondas de microscopía de fuerza atómica y evaluación de la unión célula-voladizo
Fecha: 2026
Materia: ---
Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS DE CAMINOS, CANALES Y PUERTOS
Departamento: CIENCIA DE LOS MATERIALES
Acceso electrónico: https://oa.upm.es/94728/
Director/a(s):
- Director/a: DAZA GARCÍA, Rafael
- Director/a: PÉREZ RIGUEIRO, José
Resumen: The atomic force microscope (AFM) is a scanning probe microscope with a wide range of possible applications and great relevance in biomedicine. The cantilever is the key element of this instrument, and its surface can be functionalized to modify its physical, chemical, and/or biological properties, thereby improving its features and functional performance. Cantilever functionalization is essential when specific binding of biomolecules or cells to the surface is required. Although there exist different methods for surface functionalization, not all of them have been specifically implemented in cantilevers. From a methodological perspective, this experimental work explores four crosslinking chemistries to functionalize cantilevers with the aim of specifically attaching cells. In addition, once the cantilever was properly functionalized and the cell was bound, a fast and reliable procedure was developed to verify cellcantilever attachment. For this study, DeepTipTM SiN R67 AFM chips, MicrodeckTM G 150 glass slides, and three different cell types were used: a primary culture of CD4+ T lymphocytes, RAW 264.7 immortalized macrophages, and mesenchymal stem cells. The selected crosslinkers were: (i) N-hydroxysuccinimide ester (NHS-ester) groups, (ii) reactive thiol groups using N- succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate (sulfo-LC-SPDP), (iii) bioorthogonal chemistry, and (iv) photoactivatable crosslinkers, specifically benzophenone-4-isothiocyanate. The first three chemistries gave positive results for the functionalization of both chips and glass substrates, allowing standardized protocols to be developed for each surface. In contrast, the photoactivatable crosslinkers produced positive results on glass substrates only. Subsequently, functionalized surfaces were successfully decorated with biomolecules of interest: anti-CD4 antibodies (for CD4+ T lymphocytes), anti-F4/80 antibodies (for RAW 264.7 macrophages), anti-CD86 antibodies (for activated RAW 264.7 macrophages), and concanavalin A (for mesenchymal stem cells). For cell attachment to the cantilever using bioorthogonal chemistry, a protocol was successfully implemented to functionalize mesenchymal stem cells with azide derivatives via glycan engineering. Finally, AFM optical inspection confirmed that all cell types adhered to the functionalized cantilevers. In addition, to establish a reliable verification method, the variation in the cantilevers resonance frequency after cell attachment was evaluated. As the resonance frequency depends on the mass, changes in the mass produced by cell attachment result in measurable shifts. Quantitative confirmation of cell attachment was achieved for all cell types, but the procedure was proven to be more suitable for detecting cells of a size comparable to that of mesenchymal stem cells. Detection of smaller cells is found to be in the resolution limit of the proposed method. In conclusion, this work has developed and established protocols for the functionalization and decoration of substrates and AFM chips with different biomolecules, as well as protocols for the fast and quantifiable verification of these decorations. A protocol for the functionalization of mesenchymal stem cells using bioorthogonal chemistry has also been optimized, and, finally, a procedure was developed to verify cell attachment to the cantilever by measuring changes in the resonance frequency of the cantilever. In the future, the procedures developed in this work should allow for an increased range of measurements to be performed using atomic force microscopy to study interactions between cells and biomaterials. RESUMEN El microscopio de fuerza atómica o AFM es un microscopio de sonda de barrido con un amplio abanico de posibles aplicaciones y gran relevancia en biomedicina. La superficie de los voladizos o cantilévers, elementos clave de este microscopio, es susceptible de ser funcionalizada para modificar sus propiedades físicas, químicas y/o biológicas, mejorando sus prestaciones y desempeño funcional. La funcionalización del cantiléver es fundamental cuando se requiere de la unión específica de biomoléculas o células a su superficie. Existen diversos métodos de funcionalización de superficies, pero no todos se han implementado específicamente en cantilévers. Este trabajo sigue una perspectiva metodológica, explorando cuatro químicas de entrecruzantes para la funcionalización de cantilévers con el objetivo de unir células de manera específica. Además, tras la correcta funcionalización del cantiléver y la unión de la célula, se busca elaborar un procedimiento rápido y fiable para comprobar la unión célula-cantiléver. Para la realización de este trabajo se utilizaron chips de AFM DeepTipTM SiN R67, vidrios MicrodeckTM G 150, y tres tipos celulares diferentes: linfocitos T CD4+ de cultivo primario, macrófagos de la línea inmortalizada RAW 264.7, y células madre mesenquimales. Los entrecruzantes elegidos fueron (i) grupos N-hidroxisuccinimida éster (NHS-éster), (ii) grupos tioles reactivos utilizando N-succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (sulfo-LC-SPDP), (iii) química bioortogonal y (iv) entrecruzantes fotoactivables, en concreto la benzofenona-4- isotiocianato. Las tres primeras químicas dieron resultados positivos en la funcionalización de chips y vidrios, desarrollándose protocolos estandarizados para funcionalizar cada superficie con estas químicas. En cambio, los entrecruzantes fotoactivables solo dieron resultados positivos en vidrios. Las superficies funcionalizadas se decoraron con éxito con biomoléculas de interés: anticuerpos frente a CD4 (para los linfocitos T CD4+), anticuerpos frente a F4/80 (para los macrófagos RAW 264.7), anticuerpos frente a CD86 (para los macrófagos RAW 264.7 activados), y con concanavalina A (para las células mesenquimales). Para la unión de células al cantiléver mediante química bioortogonal, se implementó con éxito un protocolo de funcionalización de las células madre con derivados de azida mediante ingeniería de glicanos. Por último, en el AFM se comprobó ópticamente la unión de todos los tipos celulares a los cantilévers funcionalizados. Para establecer un procedimiento fiable de comprobación de la unión se estudió la variación de la frecuencia de resonancia del cantiléver tras la unión de la célula. Como la frecuencia de resonancia depende de la masa, el cambio de masa producido por la unión de la célula resulta en cambios cuantificables de aquella. Se comprobó cuantitativamente la unión al cantiléver de todos los tipos celulares, encontrándose que el procedimiento es adecuado para determinar la unión de células con el tamaño de las células mesenquimales. También se ha encontrado que la detección de la unión de células de menor tamaño se encuentra en el límite de resolución del procedimiento propuesto. En conclusión, en este trabajo se han desarrollado y establecido protocolos de funcionalización y decoración con distintas biomoléculas de sustratos y chips de AFM, así como protocolos para la comprobación rápida y cuantificable de las decoraciones, se ha puesto a punto un protocolo de funcionalización de células madre mesenquimales mediante el empleo de la química bioortogonal y, finalmente, se ha desarrollado un procedimiento para verificar la unión de la célula al cantiléver mediante la medida de la variación de la frecuencia de resonancia del cantiléver. Los procedimientos desarrollados deben permitir en el futuro aumentar el rango de medidas que se pueden realizar mediante la microscopía de fuerza atómica para evaluar la interacción entre las células y los biomateriales.