Autor: PARRA HEMING, Anne Beatriz

Título: Hydrogel-based biosensing using plasmonic nanoparticle labels for optical biomarker detection

Fecha: 2026

Materia: ---

Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS DE TELECOMUNICACION

Departamento: INGENIERIA QUIMICA INDUSTRIAL Y DEL MEDIO AMBIENTE

Acceso electrónico: https://oa.upm.es/94898/

Director/a(s):

• Director/a: AHUMADA HEREDERO, Óscar
• Director/a: RAMÍREZ GARCÍA, Jorge

Resumen: Plasmonic nanoparticles are widely used in biosensing strategies because their localized surface plasmon resonance (LSPR) provides unique optical properties and is highly sensitive to the surrounding environment. Conventional LSPR biosensing platforms often rely on rigid, ultraflat and high-refractive index substrates to ensure a stable signal, however, these materials are not optimal to support biorecognition events. Hydrogels in contrast are increasingly investigated as biocompatible, three-dimensional environments more suitable for biochemical reactions to take place. One of the main challenges encountered when integrating plasmonic detection in hydrogel environments is the intrinsic nanoscale heterogeneity of hydrogels, which complicates the LSPR based readout. This thesis investigates an alternative sensing strategy in which hydrogels serve purely as immobilization matrices, while plasmonic detection is performed via AVAC, a digital plasmonic nanoparticle counting technology that does not depend on LSPR shifts. By using gold nanoparticles as secondary labels in a sandwich assay, the plasmonic signal is decoupled from hydrogel responsivity, enabling robust quantification even in biocompatible hydrated environments. In particular two hydrogel formats of increasing structural complexity were evaluated: sciPOLY3D, a surface bound, thin-layer hydrogel compatible with microarray fabrication, and fully three-dimensional thermoresponsive Poly(N-isopropilacrylamide) hydrogels. The main objectives of this thesis were i) to determine how hydrogel structure affects the plasmonic signal, ii) to develop a method for the depth-resolved detection of gold nanoparticles embedded within hydrogels, and iii) to provide an initial assessment of the biosensing capabilities of hydrogel substrates in nanoparticle-labelled immunoassays. In addition to experimental characterization, a coarse-grained computational model of PNIPAm polymerization was established, revealing how crosslinker reactivity and solvent quality drive the formation of nanoscale heterogeneous domains within the hydrogel network, which ultimately influence the optical properties of the hydrogel. Despite the nanoscale variations in hydrogel morphology altering the optical response of the nanoparticles, AVAC detection of individual nanoparticles remains robust. One of the main contributions of this work is the development of a technology capable of quantifying individual gold nanoparticles embedded in millimeter-scale hydrogels. This adaptation of AVAC measurement and GNP detection to volumetric mapping and quantification represents a significant methodological advance and provides the basis for the development of volumetric plasmonic biosensing. The biosensing assays demonstrated the feasibility of integrating hydrogel substrates with digital plasmonic readout, both in thin-layer and volumetric hydrogel formats. In conclusion, the integration of AVAC with hydrogel substrates enables robust detection of individual nanoparticles in heterogeneous hydrated environments. This strategy bridges digital counting with three dimensional sensing, and establishes a framework for future development. RESUMEN Las partículas plasmónicas son ampliamente utilizadas en estrategias de biosensado ya que su resonancia plasmónica superficial localizada (LSPR, por sus siglas en inglés) proporciona propiedades ópticas únicas y es altamente sensible al entorno. Las plataformas convencionales basadas en LSPR suelen emplear sustratos rígidos, ultraplanos y de alto índice de refracción para garantizar una señal estable. Sin embargo, estos materiales no son óptimos para favorecer el biorreconocimiento. En cambio, los hidrogeles se investigan cada vez más como entornos biocompatibles y tridimensionales más adecuados para que tengan lugar reacciones bioquímicas. No obstante, uno de los principales desafíos al integrar la detección plasmónica en entornos de hidrogel es la heterogeneidad intrínseca a nanoescala de los hidrogeles, lo que complica la lectura basada en LSPR. Esta tesis investiga una estrategia de sensado alternativa en la que los hidrogeles sirven únicamente como matrices de inmovilización, mientras que la detección plasmónica se realiza mediante AVAC, una tecnología digital de conteo de nanopartículas plasmónicas que no depende de desplazamientos en la LSPR. Al usar nanopartículas de oro como etiquetas secundarias en un ensayo tipo sándwich, la señal plasmónica se desacopla de la responsividad del hidrogel, permitiendo una cuantificación robusta incluso en entornos biocompatibles hidratados. En particular, se evaluaron dos formatos de hidrogel de creciente complejidad estructural: sciPOLY3D, un hidrogel de capa delgada unido a la superficie y compatible con la fabricación de microarrays, e hidrogeles completamente tridimensionales termorresponsivos de poli(N-isopropilacrilamida). Los principales objetivos de esta tesis fueron: i) determinar cómo la estructura del hidrogel afecta la señal plasmónica, ii) desarrollar un método para la detección en profundidad de nanopartículas de oro embebidas en hidrogeles y iii) proporcionar una evaluación inicial de las capacidades de biosensado de los sustratos de hidrogel en inmunoensayos en los que las nanopartículas actúan como etiqueta secundaria. Además de la caracterización experimental, se estableció un modelo computacional de grano grueso de la polimerización de PNIPAm, mostrando cómo la reactividad del reticulante y la calidad del disolvente impulsan la formación de dominios heterogéneos a nanoescala dentro de la red del hidrogel, los cuales influyen en las propiedades ópticas del hidrogel. A pesar de que las variaciones a nanoescala en la morfología del hidrogel alteran la respuesta óptica de las nanopartículas, la detección de AVAC de nanopartículas individuales permanece robusta. Una de las principales contribuciones de este trabajo es el desarrollo de una tecnología capaz de cuantificar nanopartículas individuales de oro embebidas en hidrogeles de escala milimétrica. Esta adaptación de la medición AVAC y la detección de GNPs al mapeo y cuantificación volumétrica representa un avance metodológico significativo y proporciona la base para el desarrollo de biosensado plasmónico volumétrico. Los ensayos de biosensado demostraron la viabilidad de integrar sustratos de hidrogel con lectura plasmónica digital, tanto en formatos de hidrogel de capa delgada como volumétricos. En conclusión, la integración de AVAC con sustratos de hidrogel permite una detección robusta de nanopartículas individuales en entornos hidratados heterogéneos. Esta estrategia combina el conteo digital con el sensado tridimensional y sienta las bases para desarrollos futuros.