Tesis:
Clonaje y expresión en Saccharomyces Cerevisiae del gen (TRK1) de Neurospora crassa que determina un transportador de potasio de alta afinidad
- Autor: SAINZ PASTOR, Loreto
- Título: Clonaje y expresión en Saccharomyces Cerevisiae del gen (TRK1) de Neurospora crassa que determina un transportador de potasio de alta afinidad
- Fecha: 1997
- Materia: CIENCIAS DE LA VIDA. Teseo;MICROBIOLOGÍA. Teseo;LEVADURAS. Teseo;METABOLISMO MICROBIANO. Teseo
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA
- Acceso electrónico:
- Director/a 1º: RODRIGUEZ NAVARRO, Alonso
- Resumen: Se ha clonado un gen de Neurospora crassa, el gen (ncTRK1), implicado en la entrada de K+ de alta afinidad. Este gen se aisló complementando la entrada defectuosa de K+ de un doble mutante de Saccharomyces cerevisiae con una genoteca genómica de N.crassa. El gen ncTRK1 de N.crassa complementó la entrada defectuosa de K+ de los mutantes trk1 trk2 de S.cerevisiae. La secuencia de aminoácidos traducida del gen ncTRK1 mostró un 63 y un 60 por ciento de homología con los transportadores de K+ TRK1 y TRK2 de S.cerevisiae respectivamente. Esta homología se produjo en mayor medida en la región que contiene los doce fragmentos intermembrana. Sin embargo, en el alineamiento de las secuencias se observó una similitud superior de ncTRK1 con TRK2 de S.cerevisiae, siendo la carencia de la larga región hidrofílica situada entre los fragmentos M3 y M4 presente en TRK1 la característica mas notable. Este gen se caracterizó por la presencia de un intrón de 50 pb situado en el extremo 5' a 11,5 pb del primer ATG de la fase de lectura abierta. La supresión de este intrón permitió una mejor expresión del gen ncTRK1 en mutantes de levadura en condiciones limitantes de K+. Los mutantes de S.cerevisiae transformados con ncTRK1 se caracterizaron por unas cinéticas de entrada de Rb+ diferentes de las observadas en N.crassa. El sistema de alta afinidad presente en células ayunadas mostro una Km de 0,1 mM y una velocidad máxima de 7 nmol.mg-1.min-1. Para células crecidas a cncentraciones milimolares de K+, se observó un sistema de baja afinidad con una Km. de 4 mM y una v max. de 5 nmol.mg-1.min-1. Ambas cinéticas presentaron dos componentes: el primero de ellos correspondía al sistema endógeno de la levadura trk1 trk2 y el segundo era propio de ncTRK1. Es de destacar también la alta discriminación existente entre K+ y Rb+, con una Ki para K+ de 5 M en células ayunadas. Los análisis de Northem así como la obtención de cDNA solamente en células ayunadas de K+ sugieren que la expresión de ncTRK1 tiene lugar principalmente cuando el K+ es limitante, y probablemente con una actividad transcripcional muy baja