Tesis:
Regulación simbiótica de la expresión del sistema hidrogenasa por NifA en R.leguminosarum bv.viciae
- Autor: MARTINEZ GONZALEZ, María Marta
- Título: Regulación simbiótica de la expresión del sistema hidrogenasa por NifA en R.leguminosarum bv.viciae
- Fecha: 2000
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA
- Acceso electrónico:
- Director/a 1º: RUIZ ARGUESO, Tomás
- Resumen: Las proteínas que intervienen en la síntesis de la hidrogenasa [Fe Ni] de R.leguminosarum bv.viciae están codificadas por una agrupación de 18 genes estrechamente ligados en el plásmido simbiótico y orientados en el mismo sentido. Esta agrupación está formada por tres unidades transcripcionales, dos de las cuales (hupSLCDEF y hupGHIJK) se expresan exclusivamente en simbiosis. Dentro de la unidad transcripcional hupSLCDEF los genes hupSL codifican para las subunidades estructurales de la hidrogenasa. Dicha unidad se expresa a partir del promotor P1.P1, es un promotor de tipo -24/-12 cuya expresión es dependiente de RpoN, de IHF y del activador transcripcional NifA. La activación dependiente de NifA de P1, fue corroborada en el fondo genético de K.pneumoniae mediante experimentos de inhibición de la nitrogenasa por múltiples copias de P1, y en el fondo de R.etli utilizando mutantes nifA en simbiosis con judías (Phaseolus vulgaris L.). La activación de P1, por NifA depende de un elemento en cis localizado entre las posiciones -170/-142. Esta región no contiene UAS consenso de unión a NifA. Mediante análisis de deleción, mutagénesis dirigida y aleatoria de los nucleótidos de esta región se demostró que la secuencia que contiene tres semicajas consenso ACAA-N5-ACAA-N12-TTGT era responsable de la unión de NifA y de la activación del promotor. En función de estos resultados se propone un modelo cooperativo de activación de P1 por NifA en el que las proteínas interaccionan directamente con el ADN a través de las semicajas y facilitan la acumulación del regulador en el promotor por interacción proteína-proteína. La unidad transcripcional hupGHIJK, que codifica para proteínas accesorias en la síntesis de una hidrogenasa activa, se expresa al menos desde un promotor P3 de tipo -24/-12 activado inespecíficamente en simbiosis con guisantes por NifA. La activación de P3 por NifA es dependiente de RpoN e independiente de IHF, así como de elementos en cis localizados delante del promotor. Se propone que NifA interacciona en este promotor directamente con el complejo RpoN-ARN polimerasa. La inespecificidad de P3 permite su activación por activadores heterólogos como NtrC. Ensayos de deleción de P3 demostraron un efecto represor de su activación por secuencias repetidas de As y Ts. La importancia del activador transcripcional NifA nos llevó a realizar un estudio de su expresión en R. leguminosarum. La organización génica de la región nifA se determinó mediante análisis de hibridación y secuenciación. Esta región incluye los genes nifH orf7lorf79 fixW2 orfW fixABC fixX nifA nifB El análisis de expresión identificó dos promotores funcionales. El promotor PfixW2, localizado delante del operón orf7l orf79 fixW2, es de tipo -24/-12, su expresión simbiótica depende de NifA y contiene UAS canónicas de unión a este regulador. El promotor PnifA, localizado delante del gen nifA, se expresa eficientemente en vida libre y pobremente en simbiosis. Se propone que el gen nifA se expresa constitutivamente en vida libre desde PnifA en ausencia de regulador o inducido por un regulador desconocido y en simbiosis su transcripción se autoregula por NifA desde el promotor PfixW2.