Tesis:
Análisis de nuevas estrategias basadas en silenciamiento génico para el control de enfermedades virales en plantas.
- Autor: VARGAS CONCHA, Yolanda Marisol
- Título: Análisis de nuevas estrategias basadas en silenciamiento génico para el control de enfermedades virales en plantas.
- Fecha: 2005
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA
- Acceso electrónico:
- Director/a 1º: TENLLADO PERALO, Francisco
- Resumen: El silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de degradación de RNA dependiente de homología de secuencia, que actúa como un sistema natural de defensa en plantas frente a infecciones virales. Se conoce además, que el RNA bicatenario (dsRNA) constituye el inductor de esta respuesta de defensa adaptativa y altamente conservada en la evolución. En este trabajo de Tesis se han abordado dos estrategias que aunque diferentes, ambas se basan en la utilización de moléculas dsRNAs derivadas de secuencias virales para interferir con la infección de los virus. La primera estrategia se basa en la expresión de dsRNA de forma estable por transgenes que codifican la transcripción de secuencias virales dispuestas en repetición invertida (IR). En este sentido, se han obtenido líneas transgénicas de Nicotiana benthamiana en las cuales se ha introducido un transgén que contiene una repetición invertida de la región 54k de la replicasa del virus del moteado suave del pimiento (PMMoV). La expresión de esta construcción produjo la acumulación estable en la planta de un transcrito de longitud correspondiente a la secuencia transgénica. En ensayos de protección frente a PMMoV, cerca del 70 por ciento de estas líneas R0 regeneradas mostraron resistencia frente al virus. Por el contrario, construcciones dispuestas en repetición directa, que codifican la misma región del virus pero sin capacidad de hibridar intramolecularmente, mostraron resistencia al virus en tan solo un 6-20 por ciento de las plantas R0 regeneradas. La resistencia a PMMoV estuvo asociada con la acumulación de pequeños RNAs de 21 y 25 nts, característicos del PTGS, en un estadío previo a la inoculación viral. Se ha caracterizado una línea R2 en homocigosis, IR4#8, que expresa el RNA bicatenario. Esta línea ha sido sometida a títulos crecientes de inóculo viral en la hoja y a una elevada y continua presión de inóculo vía haces vasculares, mediante la utilización de injertos. En todos los casos, las plantas transgénicas presentaron elevada resistencia (inmunidad) frente al virus hasta el final del ciclo vital. Por otra parte, cuando plantas de esta línea transgénica fueron inoculadas con tobamovirus con baja similitud nucleotídica con PMMoV-S, como TMV o ToMV, éstas mostraron un fenotipo de susceptibilidad, sin embargo, cuando fueron inoculadas con PMMoV-I, un tobamovirus con elevada similitud nucleotídica con PMMoV, las plantas mostraron un fenotipo de completa resistencia, indicando esto la alta especificidad del mecanismo que promueve la resistencia en estas plantas.La segunda estrategia se presenta como una alternativa a la transformación genética de plantas y se basa en la producción de dsRNAs derivados de secuencias virales en bacterias. Previamente había sido demostrado que la inoculación conjunta de virus y dsRNA derivado de secuencias virales producido in vitro, previene de manera específica la infección viral en plantas. Con objeto de contar con grandes cantidades de dsRNA que pudieran ser utilizadas en estudios de PTGS, así como para su potencial uso en el control de las enfermedades virales en plantas, se ha desarrollado un sistema de expresión inducible de estas moléculas en bacteria. Los dsRNAs así expresados corresponden a diversas secuencias genómicas derivadas de PMMoV, del virus de la sharka (PPV) y del virus Y de la patata (PVY). Los dsRNAs purificados a partir de bacteria y co-inoculados con el virus homólogo en plantas de N. benthamiana y Capsicum annuum, presentaron una interferencia específica con la infección viral. Además, cuando extractos crudos de dsRNAs obtenidos mediante el lisado de la bacteria por la Prensa Francesa, sin ningún paso adicional de purificación, fueron co-inoculados con el virus homólogo o pulverizados sobre la superficie foliar de las plantas, se observó que eran igualmente efectivos en la protección viral, incluso cuando la pulverización se había efectuado varios días antes de la inoculación del virus. No se obtuvo protección de las plantas por este método cuando la inoculación del virus se realizó mediante el vector Myzus persicae. Sin embargo, cuando las moléculas dsRNAs fueron expresadas transitoriamente en las plantas, se obtuvo una interferencia total con la transmisión del virus por el vector, resultando las plantas protegidas de la infección viral.