Tesis:
Estudio del movimiento sistémico del virus del mosaico del pepino (CMV) en plantas de pepino (Cucumis sativus L.).
- Autor: REQUENA GUTIERREZ, Andrés
- Título: Estudio del movimiento sistémico del virus del mosaico del pepino (CMV) en plantas de pepino (Cucumis sativus L.).
- Fecha: 2004
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA
- Acceso electrónico:
- Director/a 1º: GARCIA ARENAL RODRIGUEZ, Fernando
- Resumen: La infección de un virus de plantas en un huésped sistémico consta de movimiento de célula a célula desde las células inicialmente infectadas seguido de movimiento a larga distancia o movimiento sistémico, desde los órganos inicialmente infectados al resto de la planta. Si el virus no puede moverse a larga distancia, la planta es resistente a la infección. La mayor parte de los virus se mueven sistémicamente por el floema, de forma paralela al flujo de fotoasimilados. Se ha descrito que la gran mayoría de los virus necesitan la proteína de la cápsida para realizar este movimiento, y que hay interacciones entre factores del huésped y factores del virus cuando el virus accede al sistema vascular y/o al tubo criboso. Sin embargo, no se tienen evidencias directas de cual es la estructura del virus que se transloca por el floema, y no se han descrito interacciones entre factores del virus y factores de la planta durante esta etapa del movimiento sistémico. En esta tesis se analiza la estructura viral que se transloca por el floema de plantas infectadas, y si esta estructura interacciona con factores del floema Para ello, se ha estudiado el movimiento sistémico del virus del mosaico de pepino (CMV) en plantas de pepino (Cucumis sativus L.). El pepino es una planta muy adecuada para estudiar la translocación del virus por el floema, ya que seccionando tallos y peciolos se obtienen muestras de exudado de floema de pepino que, por su composición y propiedades, pueden considerarse muestras de la savia circulante por el floema. Para analizar como se transloca CMV por el floema se ha comparado la densidad de la estructura de CMV presente en el exudado de floema de pepinos infectados con la densidad de partículas virales mediante centrifugación en gradientes de sacarosa, y se observó que los perfiles de sedimentación obtenidos son similares, lo que sugiere que la estructura de CMV que se transloca por el floema es la partícula viral. La observación de muestras de exudado de floema de pepinos infectados al microscopio electrónico confirmó la presencia de viriones. Los resultados obtenidos permiten concluir que la estructura mayoritaria de CMV que se transloca en el floema de pepino es la partícula viral. La centrifugación en gradientes de sacarosa mostró que una fracción de las partículas de CMV que se translocan por el floema de pepino tenía menor densidad que el resto, lo que sugiere que las partículas pudieran asociarse con componentes del floema. Se analizó si la posible asociación modificaba la accesibilidad a ribonucleasa A del RNA encapsidado. Se observó que el RNA encapsidado en las partículas de CMV presentes en el exudado de floema de pepinos infectados y el RNA encapsidado en partículas de CMV mezcladas con exudado de floema de pepinos no inoculados era menos accesible a ribonucleasa A que el RNA encapsidado en partículas virales. Se obtuvieron fracciones del exudado de floema de pepinos no inoculados dializando el exudado para retirar compuestos de bajo peso molecular y realizando una extracción fenólica para retirar proteínas, y se determinó que el componente de exudado de floema de pepino que disminuye la accesibilidad a ribonucleasa A del RNA encapsidado son las proteínas. Se han analizado las interacciones in vitro entre las proteínas presentes en el exudado de floema de pepino, separadas por electroforesis en condiciones desnaturalizantes y transferidas a una membrana de PVDF y las partículas de CMV. Se observó que las partículas de CMV interaccionan con proteínas de peso molecular aparente de 69, 48, 44, 32 y 18 k Da del exudado de floema de pepino. Comparando la interacción entre partículas del virus de la aspermia del tomate, del virus del moteado y mosaico verde del pepino, y partículas de CMV con las proteínas de exudado de floema de pepino se observó que las proteinas p69, p48 y p44 interaccionan de forma especifica con las partículas de CMV; y estudiando la interacción entre partículas de CMV y proteínas del exudado de floema en concentraciones crecientes de NaCI, se determinó que las partículas de CMV tienen mayor afinidad por la proteína p48. Se purificó esta proteína del exudado de floema de pepinos no inoculados y se obtuvieron secuencias aminoacídicas internas que se emplearon para realizar búsquedas en las bases de datos. Estas búsquedas no permitieron identificar proteínas homólogas a la p48, pero se observó que la p48 tiene una limitada homología de secuencia con proteínas codificadas por ellocus S de Brassica, concretamente con glicoproteínas y con receptores transmembrana con actividad kinasa. Estas proteínas participan en procesos de interacción proteína-proteína, lo que puede sugerir que la p48 podría participar en ese tipo de interacción durante la translocación del virus por el floema Para analizar si las partículas de CMV y la p48 interaccionan en la savia circulante por el floema de pepinos infectados, se compararon sus perfiles de sedimentación tras centrifugar muestras de exudado de floema de pepinos infectados en gradientes de densidad. No se observó que tuvieran perfiles de sedimentación similares, lo que sugiere que no existe interacción in vivo, aunque no debe descartarse que la interacción ocurra pero que el método empleado no permita detectarla.