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Tesis:

Análisis de la expresión del sistema hidrogenasa de Rhizobium leguminosarum en simbiosis con leguminosas. Factores limitantes y aplicaciones agronómicas.

  • Autor: URETA BARRIOS, Ana Claudia

  • Título: Análisis de la expresión del sistema hidrogenasa de Rhizobium leguminosarum en simbiosis con leguminosas. Factores limitantes y aplicaciones agronómicas.

  • Fecha: 2006

  • Materia: Sin materia definida

  • Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS

  • Departamentos: BIOTECNOLOGIA

  • Acceso electrónico:

  • Director/a 1º: PALACIOS ALBERTI, José

  • Resumen: En la simbiosis Rhizobium-leguminosas existen dos enzimas clave que intervienen en el metabolismo del hidrógeno molecular (H2): la nitrogenasa y la hidrogenasa. La nitrogenasa cataliza la reducción de nitrógeno atmosférico a amonio y este proceso conlleva la producción de hidrógeno. Este hidrógeno se pierde como gas por lo que constituye una pérdida de energía en el proceso de fijación de nitrógeno. Las hidrogenasas catalizan la oxidación de hidrógeno molecular a protones. Los electrones provenientes de la oxidación de hidrógeno se incorporan a la cadena respiratoria hasta el aceptor final que es el oxígeno y en este proceso puede estar acoplado a la producción de energía (Ruiz-Argüeso et al, 2000). El reciclado de hidrógeno se ha asociado a un aumento de la productividad de las plantas debido al incremento de la eficiencia energética en la simbiosis Rhizobium-leguminosas. La hidrogenasa es una enzima heterodimérica que está unida a la membrana y contiene un centro activo bimetálico [NIFe] en la subunidad mayor. La incorporación de níquel en el centro activo de la hidrogenasa es un paso esencial en la síntesis de la enzima. Se ha establecido que la disponibilidad de níquel limita la expresión de la hidrogenasa a nivel de procesamiento de las subunidades de la enzima en plantas crecidas en vermiculita (Brito et al, 1994) pero se desconoce si esta limitación existe en condiciones naturales de cultivo. Los objetivos de esta tesis doctoral son: 1.- Analizar el nivel de níquel del suelo como posible factor limitante en la expresión de la actividad hidrogenasa en suelos agrícolas Para este estudio se analizó el efecto de la adición de níquel a los suelos. Se seleccionaron 6 suelos agrícolas representativos de la Comunidad de Madrid de los que se determinaron sus características físico-químicas. Estos suelos se usaron como sustrato para el crecimiento de guisantes (Pisum sativum) inoculados con una cepa hidrogenasa positiva de de R. leguminosarum. El análisis del metabolismo del hidrógeno en los bacteroides de estas plantas demostró que el Ni presente en estos suelos no es suficiente para reciclar el 100 por ciento del hidrógeno producido en el proceso de fijación de nitrógeno. Como estrategia para superar la limitación por níquel se usó una cepa más eficiente en el reciclado de hidrógeno. Estos resultados se correlacionaron con ensayos de inmunodetección donde se analizó el efecto del níquel en el procesamiento de la subunidad mayor de la hidrogenasa y se vio que el procesamiento de la enzima depende de los niveles de níquel del suelo. Los resultados indican que los bajos niveles de níquel de los suelos constituyen un factor limitante para la actividad hidrogenasa en la simbiosis R. leguminosarum-guisantes. 2.-Evaluar el beneficio asociado a la presencia del sistema hidrogenasa en inoculantes rizobianos Para evaluar el beneficio asociado a la presencia del sistema hidrogenasa en inoculantes rizobianos, se integró el sistema hup de Rhizobium leguminosarum bv viciae a cepas hidrogenasa negativas noduladoras de veza (Vicia sativa) mediante el uso de un minitransposón (TnHB100, Báscones et al, 2000). Este sistema permitió integrar en forma estable la agrupación hup en el genoma de la bacteria receptora. Se seleccionaron dos cepas con inserciones localizadas en sitios no relevantes del genoma y se analizó la actividad hidrogenasa y el comportamiento simbiótico. Una de las cepas mostró incrementos significativos en acumulación de nitrógeno asociada a la presencia de la capacidad de reciclado de hidrógeno. 3.- Realizar un análisis comparativo de genomas de cepas de Rhizobium leguminosarum capaces de expresar el sistema hidrogenasa Se realizó la comparación genotípica de las cepas de R. leguminosarum UPM791, poseedora del sistema hup, y 3841, cuyo genoma ha sido secuenciado, utilizando microarrays de ADN generados para la cepa 3841. Previo al estudio comparativo se verificó que el sistema hup se expresa correctamente en la cepa 3841. La comparación reveló que el 78 por ciento de los genes se encontraban conservados en ambas cepas, indicando que estos microarrays son útiles para el análisis de los factores involucrados en el control de la expresión de la hidrogenasa de UPM791.