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Tesis:

Análisis de la interacción melón (Cucumis melo L.)-Melón necrotic spot virus (MNSV) controlada por el gen recesivo NSV.

  • Autor: NIETO GARCIA, Cristina

  • Título: Análisis de la interacción melón (Cucumis melo L.)-Melón necrotic spot virus (MNSV) controlada por el gen recesivo NSV.

  • Fecha: 2006

  • Materia: Sin materia definida

  • Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS

  • Departamentos: BIOTECNOLOGIA

  • Acceso electrónico:

  • Director/a 1º: ARANDA REGULES, Miguel Angel

  • Resumen: Las enfermedades causadas por virus constituyen un problema creciente en la agricultura moderna e intensiva. El ciclo de infección viral es un proceso complejo que requiere la interacción a diferentes niveles entre factores del huésped y factores del virus. El estudio de los procesos implicados en la interacción molecular entre los virus y los factores celulares puede generar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de resistencia y permitir el desarrollo de resistencias frente a virus más durables y de amplio espectro El Virus de las manchas necróticas del melón (Melón necrotic spot virus, MNSV) es un virus de RNA de sentido positivo endémico de los cultivos de cucurbitáceas del mundo entero. El gen recesivo nsv de melón (Cucumis melo L.) confiere resistencia a todos los aislados de MNSV, excepto MNSV-264. Este aislado posee además la capacidad de infectar huéspedes que no pertenecen a la familia de las cucurbitáceas (Nicotiana benthamiana y Gomphrena globosa). Un estudio que utilizó los mutantes quiméricos construidos entre MNSV-264 y MNSV-M 5 (un aislado avirulento) ha mostrado que el determinante de avirulencia de MNSV reside en la región 3'-terminal del genoma viral. En estudios anteriores se ha identificado el factor de iniciación de traducción en eucariotas de melón, Cm-eIF4E como gen candidato a nsv. Un objetivo principal de esta Tesis ha sido la caracterización de de la interacción molecular entre MNSV-nsv. Para abordar este estudio se han llevado a cabo ensayos de complementación en melón mediante la expresión transitoria del alelo de susceptibilidad de Cm-eIF4E en genotipos resistentes de melón. Estos ensayos permitieron la multiplicación de MNSV-M 5, confirmando que Cm-eIF4E es el producto codificado por nsv. Se trata pues, del primer ejemplo de una resistencia recesiva mediada por eIF4E efectiva frente a un virus no poliadenilado, sin 5'cap y que no pertenece a la familia Potyviridae. En este trabajo se ha realizado una caracterización molecular de la región de MNSV implicada como determinante de avirulencia. Los experimentos realizados han mostrado que el determinante de avirulencia se trata de una molécula de RNA per se. Al mismo tiempo se han identificado en las predicciones de la estructura secundaria de 3UTRs de varios aislados de MNSV posibles elementos estructurales que pudieran estar implicados en la superación de la resistencia. Es el primer caso descrito en el que el determinante de avirulencia que interacciona con eIF4E, directa o indirectamente, es una molécula de RNA. El control de MNSV está basado principalmente en el uso de variedades que incorporan el gen nsv. En este trabajo se ha realizado una búsqueda de nuevas fuentes de resistencia natural a MNSV mediante el escrutinio fenotípico de 147 entradas de C. melo y especies afines tras su inoculación mecánica. Los resultados obtenidos han mostrado la existencia de 2 entradas de C. melo y 4 de especies afines resistentes a MNSV-M 5. Tan sólo una entrada, C. zehyeri resultó no infectarse por ninguno de los dos aislados. La utilidad de las entradas de especies afines a C. melo dependerá, en gran medida del desarrollo de estrategias de transferencia de genes que superen las barreras de compatibilidad con C. melo. Por otra parte, en este estudio hemos adaptado y puesto a punto la técnica del EcoTILLING para melón con la misma colección utilizada en el escrutinio fenotípico. Esta técnica ha sido aplicada como escrutinio genético y ha permitido confirmar la correlación entre un SNP (cambio de un solo nucleótido) encontrado en el genotipo resistente de melón y la resistencia frente a MNSV. Gracias a la aplicación del EcoTILLING se ha analizado la variabilidad de Cm-eIF4E de las entradas de la colección, se ha realizado una búsqueda de nuevos alelos de resistencia y se ha analizado la posible correlación entre los haplotipos encontrados y la resistencia/susceptibilidad frente a otros virus para los que la colección había sido anteriormente caracterizada. Por último, otro de los objetivos planteados ha sido la caracterización molecular de la interacción MNSV-N. benthamiana. Los ensayos de complementación llevados a cabo mostraron que el alelo de susceptibilidad de Cm-eIF4E no complementa la infección de MNSV-M 5 en esta especie. Esto sugiere que los mecanismos que controlan la resistencia en N. benthamiana y melón sean diferentes. La homología de las predicciones de estructura secundaria de 3'UTR de los aislados avirulentos con secuencias precursoras de miRNA planteó la posibilidad de la implicación de mecanismos de silenciamiento mediadas por RNAs de pequeño tamaño. Se llevaron a cabo análisis por Northern-blot que mostraron la existencia de RNAs de pequeño tamaño codificados por N. benthamiana con homología con 3'UTR del genoma de MNSV-M 5.