Tesis:
Diversidad en los transportes de potasio y sodio en células eucariotas no animales. Establecimiento de Physcomitrella patens como organismo modelo.
- Autor: BARRERO GIL, Javier
- Título: Diversidad en los transportes de potasio y sodio en células eucariotas no animales. Establecimiento de Physcomitrella patens como organismo modelo.
- Fecha: 2007
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA
- Acceso electrónico:
- Director/a 1º: BENITO CASADO, Begoña
- Resumen: En este estudio se han desarrollado varias líneas de investigación, siguiendo principalmente dos aproximaciones distintas: la caracterización de sistemas de transporte que pudieran tener interés biotecnológico en el ámbito del incremento de la tolerancia a la salinidad de los cultivos y el establecimiento de Physcomitrella patens como organismo modelo en estudios de homeostasis iónica. Identificación y caracterización de Na+,K+-ATPasas en algas Las bombas de Na+ son sistemas muy eficientes en la extrusión de Na+ hacia el exterior celular por lo que son de gran interés biotecnológico. En este estudio hemos realizado una búsqueda de bombas de Na+ en algas macroscópicas marinas identificando y clonando dos cDNAs, uno en una especie marina de alga roja Porphyra yezoensis y otro en otra especie marina de alga verde Udotea petiolata.. Ambas secuencias muestran gran homología con Na+K+-ATPasas de origen animal, nombrándose KPA1. Hemos caracterizado la función de la bomba PyKPA1 de Porphyra, mediante expresión heteróloga en bacterias y levaduras, como un sistema capaz de mediar una entrada de K+ y una salida de Na+. Mediante búsquedas informáticas en bases de datos hemos podido identificar secuencias relacionadas con este tipo de ATPasas en el alga verde Chlamydomonas reinhardtii y el estramenopilo Phytophthora sojae. Estos resultados sugieren que las bombas de Na+/K+ no sólo se hallan presentes en animales, sino que están presentes en diversos organismos como estramenopilos, algas rojas, y algas verdes. Su implicación en la homeostasis iónica necesita estudios más detallados. 2. Caracterización del transporte de K+ en el musgo Physcomitrella patens Se han establecido técnicas de cultivo y manipulación genética básicas en el laboratorio. Hemos caracterizado las respuestas al ayuno de nutrientes de esta planta mostrando su capacidad para absorber K+ con alta afinidad, las características de este transporte sugieren la implicación de un transportador KUP/HAK/KT. Además, algunos indicios sugieren que un transportador de esta familia también podría intervenir en la absorción de K+ en plantas con un contenido normal de K+. Se han clonado cuatro genes que codifican transportadores HAK en Physcomitrella, escogiéndose dos de ellos para su caracterización funcional (PpHAK1 y PpHAK2). Se ha establecido la localización subcelular del transportador PpHAK1 en la membrana plasmática. En el caso de PpHAK2 se han obtenido algunos indicios que apuntan a su localización en el tonoplasto. Los resultados de experimentos de expresión heteróloga de PpHAK1 y PpHAK2 en mutantes de levadura sugieren fuertemente la capacidad de PpHAK1 para mediar flujos de entrada de K+ de alta afinidad. También se han identificado y clonado en Physcomitrella dos secuencias con pertenecientes a familia de canales iónicos tipo Shaker (PpAKT1 y PpAKT2). Se ha podido establecer la función de PpAKT1 como sistema de absorción de K+ mediante la expresión heteróloga en mutantes de levadura. Se ha logrado la interrupción del gen PpHAK1 en Physcomitrella. La línea mutante hak1 parece tener los sistemas de transporte de K+ de alta y baja afinidad, muy afectados, lo cual sugiere que el transportador PpHAK1 puede estar implicado en ambos modos de transporte de K+. 3. Clonación y caracterización de un transportador NHAD en Physcomitrella La homeostasis del Na+ en Physcomitrella es particularmente interesante ya que es la única planta conocida en la que bombas de Na+ y antiportadores Na+/H+ coexisten. En este trabajo, nos hemos planteado la caracterización de uno de los presuntos antiportadores Na+/H+ de Physcomitrella, el antiportador PpNHAD1. Este transportador pertenece a una familia muy poco conocida. Una búsqueda electrónica nos ha permitido descubrir que los transportadores NHAD están muy ampliamente distribuidos entre los organismos eucariotas fotosintéticos, lo cual nos ha llevado a clonar el cDNA PpNHAD1. La construcción de una fusión del cDNA de PpNHAD1 con GFP ha permitido demostrar la localización de este transportador en la envoltura del cloroplasto. Utilizando Li+ como catión análogo a Na+, hemos podido demostrar mediante expresión heteróloga su función como transportador de Na+. Esta función parece ser dependiente de un pH ácido. Sorprendentemente, este transportador también parece mediar un flujo de entrada de K+, siendo esta función independiente del pH. Así pues, parece que PpNHAD1 es un transportador de la envoltura cloroplástica implicado en la homeostasis iónica de este orgánulo.