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Tesis:

Análisis comparativo de la expresión e interferencia génica de dos acetilcolinesterasas en Blatella germánica (L) (Dyctioptera blattellidae) y en Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleóptera Chrysimelidae).

  • Autor: REVUELTA LUIS, Löic

  • Título: Análisis comparativo de la expresión e interferencia génica de dos acetilcolinesterasas en Blatella germánica (L) (Dyctioptera blattellidae) y en Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleóptera Chrysimelidae).

  • Fecha: 2010

  • Materia: Sin materia definida

  • Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS

  • Departamentos: BIOTECNOLOGIA

  • Acceso electrónico:

  • Director/a 1º: TENLLADO PERALO, Francisco
  • Director/a 2º: HERNANDEZ CRESPO, Pedro

  • Resumen: La Acetilcolinesterasa (AChE, EC 3.1.1.7) es una enzima esencial en las sinapsis colinérgicas de todos los animales, incluyendo los insectos. La AChE termina el impulso nervioso mediante la hidrólisis rápida del neurotransmisor acetilcolina en el espacio sináptico. En insectos, la AChE ha sido estudiada principalmente en relación con la resistencia a insecticidas, ya que esta enzima es diana de los insecticidas organofosforados y carbamatos y su insensibilidad es uno de los principales factores que conlleva resistencia. En insectos se ha descrito la existencia de dos genes (ace1 y ace2) que codifican dos subfamilias de acetilcolinesterasas (AChE1 y AChE2, respectivamente). Las evidencias obtenidas hasta la fecha indican que la mayoría de las especies de insectos poseen los dos genes, ace1 y ace2. La excepción se encuentra en las especies del grupo Cyclorrhapha, entre las que se encuentra Drosophila melanogaster, que posiblemente poseen un único gen, ace2. Actualmente, se desconoce el sentido funcional de la existencia de dos AChEs. A pesar de las evidencias mencionadas, en el escarabajo de la patata, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), sólo se conoce un gen ace, Ldace2. En la presente tesis doctoral se describe la clonación y la secuenciación de un nuevo gen ace en L. decemlineata (Ldace1). Se ha estudiado la expresión de ambos genes ace, Ldace1 y Ldace2, en diferentes etapas de desarrollo de esta especie. Los niveles de expresión fueron siempre mayores para Ldace1 en comparación con Ldace2. Además, se utilizó la técnica de Interferencia por RNA (RNAi) para silenciar la expresión de ambos genes de L. decemlineata y de Blattella germanica (L.) (Dyctioptera: Blattellidae) mediante la inyección de RNAs bicatenarios (dsRNAs) específicos. El objetivo fue valorar la contribución de cada AChE, AChE1 y AChE2, a la actividad AChE total así como su impacto en la supervivencia del insecto y en la sensibilidad a insecticidas. El silenciamiento de los tránscritos de los genes ace1 o ace2 fue cercano al 100%, siete días después de la inyección. También se observó una reducción de la actividad AChE, aunque menos pronunciada, probablemente debido a la larga vida de esta enzima. La reducción en la actividad AChE fue significativamemte superior en los insectos en los que se silenció la expresión de ace1 (46-49%, según la especie y el tejido) en relación a los insectos en los que se interfirió ace2 (11-16%). Usando medidas espectrofotométricas y zimogramas, se obtuvieron evidencias de que AChE1 representa el 65-75% de la actividad AChE total en el tejido nervioso tanto de L. decemlineata como en B. germanica, demostrándose que el gen ace1 codifica una AChE predominante. Es más, el silenciamiento de la expresión del gen ace1 pero no del gen ace2 en L. decemlineata redujo significativamente la supervivencia del insecto, lo que remarca el papel fisiológico esencial de Ldace1 en la vida de L. decemlineta. Además, en los insectos de las dos especies, L. decemlineata y B. germanica, en los que se silenció ace1 se observó un aumento significativo en la sensibilidad al insecticida organofosforado clorpirifos que no ocurrió cuando se silenció el gen ace2. También, el silenciamiento de la expresión del gen ace1, pero no del gen ace2, produjo un incremento de mortalidad frente al piretroide ¿-cialotrina en B. germanica. Los resultados obtenidos en este trabajo aportan nuevos datos que sugieren que AChE1 contribuye mayormente a la actividad AChE y presenta una función esencial, a nivel cualitativo y/o cuantitativo, como diana de insecticidas en insectos. La función de AChE2 en la fisiología del sistema nervioso de insectos no pertencientes al grupo Cyclorrhapha deberá ser aclarada en estudios posteriores. Este trabajo podrá servir de base para el estudio del RNAi como estrategia directa o complementaria con el uso de insecticidas, para el control de plagas mediante el silenciamiento de genes esenciales del insecto.