Tesis:
Bases moleculares de la resistencia a insecticidas en la mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata (Wiedemann).
- Autor: COUSO FERRER, Francisco
- Título: Bases moleculares de la resistencia a insecticidas en la mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata (Wiedemann).
- Fecha: 2012
- Materia: Biología, Agricultura, Zoología
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA
- Acceso electrónico: http://oa.upm.es/14658/
- Director/a 1º: HERNANDEZ CRESPO, Pedro
- Resumen: La mosca mediterránea de la fruta Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) está considerada una de las especies plaga más importantes. Hasta el año 2009, año en el que dejó de emplearse el malatión, el uso de este organofosforado en España se había incrementado progresivamente debido a las grandes pérdidas económicas que ocasionaba C. capitata en los cultivos de cítricos. Este incremento, tanto en la concentración de malatión como en la frecuencia de los tratamientos, provocó la aparición de poblaciones de campo resistentes. El estudio de una población resistente a malatión, recogida en Castelló en 2004, permitió la identificación de dos mecanismos de resistencia: una mutación puntual (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE), y un mecanismo de resistencia metabólica, probablemente mediado por esterasas. Teniendo en cuenta estos antecedentes, nos propusimos estudiar en profundidad los mecanismos implicados en la resistencia a insecticidas en C. capitata. Además, durante el desarrollo de esta Tesis, el malatión dejó de ser utilizado en la Unión Europea, siendo sustituido por otros insecticidas como el espinosad y la lambda-cialotrina. En este nuevo contexto, se planteó la necesidad de analizar la posible existencia de resistencia cruzada a estos insecticidas, analizar la susceptibilidad de poblaciones de campo a espinosad, y sentar las bases para el estudio de futuros mecanismos de resistencia. En primer lugar, analizamos la susceptibilidad a malatión y espinosad en doce poblaciones de C. capitata de Andalucía, Aragón, Cataluña, Comunidad Valenciana e Islas Baleares. Detectamos la presencia de individuos resistentes a malatión en todas las poblaciones, aunque en la mayoría de ellas su frecuencia fue baja.. En el caso del espinosad, observamos que la susceptibilidad al insecticida de origen biológico fue elevada en la mayoría de las poblaciones, sin embargo, la población recogida en Xàbia (Alicante) mostró un nivel de susceptibilidad unas dos veces menor al resto de poblaciones. Mediante la selección en laboratorio, obtuvimos dos líneas resistentes a malatión, W-4Km y W-10Km, con unos niveles de resistencia con respeto a la línea susceptible C de 178 y 400 veces, respectivamente. Además, se seleccionó por primera vez en C. capitata, una línea altamente resistente a espinosad (Xàbia-W-100s), que es unas 500 veces más resistente que la línea de laboratorio C. Con el objetivo de escoger la estrategia más adecuada para el manejo de la plaga, estudiamos la susceptibilidad a diferentes tipos de insecticidas en la línea W-4Km resistente a malatión. En la línea W-4Km detectamos resistencia cruzada moderada a los organofosforados fentión, diazinón, fosmet, triclorfón y metil-clorpirifos (7 a 16 veces) y resistencia cruzada leve frente al carbamato carbaril, al piretroide lambda-cialotrina y al quimioesterilizante lufenurón (4 a 6 veces). Por otra parte, la resistencia cruzada frente a espinosad fue muy reducida (1,5 veces). Es importante destacar que los niveles de resistencia frente a todos los insecticidas fueron de un orden de magnitud inferior al observado en la línea W-4Km frente a malatión (178 veces), hecho que podría deberse a dos posibles hipótesis: que la mutación AChE G328A confiera mayor insensibilidad a malaoxón (forma activa del malatión) que a otros insecticidas que tienen como diana la AChE, y/o en segundo lugar, que el mecanismo de resistencia mediado por esterasas hidrolice el malatión de manera más eficiente que los otros insecticidas analizados. En el estudio de nuevos mecanismos de resistencia en C. capitata, analizamos la diversidad de las enzimas citocromo P450, que intervienen en procesos de resistencia metabólica y la posibilidad de que apareciesen nuevas mutaciones puntuales en los genes que codifican la acetilcolinesterasa (Ccace2) y la aliesterasa (Ccae7). Mediante el empleo de cebadores degenerados obtuvimos 37 genes CYP, que codifican enzimas P450, pertenecientes a cinco familias. Posteriormente, en un estudio de inducción con fenobarbital, observamos que la expresión de cuatro de los seis genes analizados era susceptible de ser inducida. Por otro lado, se puso a punto un sistema que permite amplificar y secuenciar, a partir de DNA genómico, los exones de los genes Ccace2 y Ccae7 en los que se han encontrado mutaciones relacionadas con resistencia a insecticidas en otras especies. Los resultados obtenidos facilitarán el estudio de nuevos mecanismos de resistencia en C. capitata mediados por estas enzimas. Se diseñó un método PCR-RFLP para detectar individuos portadores del alelo de resistencia Ccace2R sin la necesidad de realizar bioensayos y que, además, permite detectar resistencia cuando ésta se encuentra a baja frecuencia. Este método se aplicó como sistema de diagnóstico de la presencia de la mutación AChE G328A en poblaciones de campo de C. capitata. Según el análisis realizado, el alelo de resistencia se observó en 25 de las 27 localidades muestreadas en todo el territorio español, incluyendo las Islas Baleares y Canarias. Sin embargo, este alelo no se detectó en poblaciones recogidas en once países de cinco continentes. El seguimiento de la presencia del alelo Ccace2R en las líneas resistentes a malatión mostró una rápida disminución de los homocigotos silvestres susceptibles y de los homocigotos para el alelo de resistencia. Así, después de 52 generaciones de selección, se observó que la totalidad de los individuos analizados de la línea W-10Km presentaban un genotipo heterocigoto para la mutación AChE G328A, dato que contradice la segregación mendeliana esperada para un gen con dos alelos. Posteriormente, demostramos la existencia de una duplicación del gen que codifica la acetilcolinesterasa mediante: i) el cruzamiento de individuos heterocigotos de la línea W-10Km con homocigotos susceptibles de la línea C, que dio lugar a una descendencia en la que el 100% de los individuos eran heterocigotos; ii) la evaluación del número de copias del gen Ccace2 por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), que resultó dos veces mayor en individuos de la línea W-10Km en comparación con la línea C; iii) el análisis del nivel de expresión de Ccace2, que fue el doble en la línea W-10Km con respecto a la línea C, iv) el estudio de la actividad acetilcolinesterasa, que resultó mayor en los individuos de la línea W-10Km. La duplicación del gen Ccace2 da lugar a la coexistencia en un mismo cromosoma de una copia del alelo silvestre y otra del alelo mutado que confiere resistencia a malatión. Estos alelos, al estar ligados, provocan una heterocigosis permanente (Ccace2RS). Se ha detectado un coste biológico asociado a la duplicación que consiste en un ligero retraso en el desarrollo de los huevos y de las pupas, y en un incremento en la mortalidad acumulada de los adultos a partir del séptimo día después de la emergencia. La descripción de la duplicación Ccace2RS supone la identificación de un nuevo mecanismo de resistencia a malatión en C. capitata. Finalmente, mediante el diseño de un método de doble PCR-RFLP se determinó la presencia de la duplicación Ccace2RS en la mayoría de las poblaciones españolas. Observamos que la proporción de individuos portadores de la duplicación osciló entre el 5 y el 35%, siendo mayor la frecuencia en las poblaciones de C. capitata recolectadas en la cuenca mediterránea. Podemos por lo tanto concluir que la resistencia a malatión asociada a la mutación AChE G328A y a la duplicación Ccace2RS está ampliamente distribuida en las poblaciones españolas de C. capitata. Nuestros resultados desaconsejan la utilización del malatión (si fuera de nuevo autorizado) o de otros OPs para el control de esta plaga. Además, una de las líneas resistentes a malatión mostró resistencia cruzada frente a insecticidas con diferentes modos de acción y que se utilizan actualmente para el control, tales como lambda-cialotrina y lufenurón. La alta susceptibilidad a spinosad observada en las poblaciones españolas, así como la reducida resistencia cruzada estimada para este insecticida, sugieren su adecuación para el control. Sin embargo, mediante selección en laboratorio se obtuvo una población altamente resistente a este insecticida, lo que pone de manifiesto el riesgo de utilizar un sólo insecticida. Por tanto, en C. capitata es aconsejable implementar programas de manejo de la resistencia basados en el uso de insecticidas con diferentes mecanismos de acción y distintos sistemas de control, que permitan su sostenibilidad en el tiempo. Los sistemas de detección de alelos de resistencia desarrollados en este trabajo permitirán la detección precoz de resistencia en campo. Además, los conocimientos generados podrán contribuir al desarrollo de nuevos sistemas de detección para otros mecanismos de resistencia.