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Tesis:

Aspectos epidemiológicos de la resistencia de Monilinia fructicola y M. laxa a fungicidas en huertos de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro

  • Autor: EGÜEN RECUERO, Beatriz

  • Título: Aspectos epidemiológicos de la resistencia de Monilinia fructicola y M. laxa a fungicidas en huertos de melocotonero y nectarino del Valle del Ebro

  • Fecha: 2016

  • Materia: Sin materia definida

  • Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS

  • Departamentos: BIOTECNOLOGIA

  • Acceso electrónico: http://oa.upm.es/40523/

  • Director/a 1º: CAL Y CORTINA, María Antonieta de

  • Resumen: Monilinia laxa y M. fructigena han sido hasta 2006 los agentes causales de la marchitez de brotes y flores y de la podredumbre de los frutos en Espana. A partir de 2006, la nueva especie M. fructicola ha sido detectada en huertos del Valle del Ebro, una de las primeras regiones productoras de fruta de hueso en Espana. Una serie de factores morfologicos y de patogenesis, asi como el estado telemorfo descrito para esta especie y una mayor propension al desarrollo de resistencia a fungicidas, han permitido una rapida adaptacion de este patogeno en otras regiones del planeta. El proposito de esta tesis ha sido determinar la frecuencia relativa de estas tres especies a raiz de la nueva introduccion, asi como validar las hipotesis anteriormente enunciadas, estudiando las diferentes fuerzas evolutivas que participan en el exito adaptativo de M. fructicola en Espana. En primer lugar, se llevaron a cabo 17 muestreos de campo en 4 huertos comerciales durante 6 temporadas consecutivas entre 2006 y 2011 para determinar la frecuencia de cada una de las tres especies M. laxa, M. fructigena, y M. fructicola y su contribucion relativa a la enfermedad en melocotones y nectarinas del Valle del Ebro. Las frecuencias relativas de Monilinia spp. fueron determinadas en tres fuentes de inoculo primario y en tres fuentes de inoculo secundario. Significativamente, (P=0.05) la mayor frecuencia relativa se alcanzo en fruta momificada en los arboles (aprox. 42 %) y en la fruta en postcosecha (32%), seguidas por la fruta momificada en el suelo de los huertos (14 %), las ramas de poda en el suelo (8 %) y las infecciones latentes en fruta inmadura (3 %). Se observo que: (a) la frecuencia relativa de M. fructicola se ha incrementado a lo largo de los anos y coexiste al mismo nivel que M. laxa, (b) M.fructigena ha dejado de ser una de las especies responsables de la podredumbre parda en melocoton, (c) una reduccion progresiva en la fecha de aparicion de las primeras conidias aereas deMonilinia spp.(r=−0.30, P=0.003), y de la primera infeccion latente (r=−0.44,P=0.0001) a lo largo de los anos, aunque (d) estos desplazamientos no estan asociados a un incremento de la enfermedad. El incremento de M. fructicola ha sido debido a un incremento significativo de su presencia en frutos a los 7 dias de la cosecha (r=0.73, P=0.0009), en infecciones latentes de fruta inmadura (r=0.68, P=0.002), en ramas de poda en el suelo del huerto (r=0.56, P=0.018), y en fruta momificada en los arboles (r=0.53, P=0.03). Este progresivo incremento, fue acompanado por una progresiva reduccion de la frecuencia relativa de M. laxa en fruta de postcosecha (r=−0.55, P=0.021) y en M. fructigena en momias de los arboles (r=−0.51, P=0.03). Para determinar los factores que pueden estar asociados a este desplazamiento de las especies, se estudio la capacidad de M. fructicola para generar nuevas combinaciones genotipicas bajo condiciones de laboratorio. Se estudiaron la morfologia y habilidad parasitica de diez aislados de campo de M. fructicola y de M. laxa, que habian sido recogidos de tres huertos diferentes del Valle del Ebro y muestreados en cinco tipos diferentes de lesiones. Para determinar la compatibilidad vegetativa, se generaron mutantes auxotrofos de la ruta del nitrato (mutantes nit) comprobando el crecimiento de sus colonias, bien cultivados individualmente o en parejas en medios con diferentes fuentes de nitrogeno. Se identificaron cinco grupos de compatibilidad vegetativa (VCGs) para los aislados de M. fructicola utilizando los mutantes nit y seis VCGs en agar patata dextrosa (PDA). Todos los casos de compatibilidad vegetativa registrados en M. fructicola procedieron de aislados del mismo huerto. Las caracteristicas morfologicas y de fitness fueron unicas para cada VCG. No fue posible identificar VCGs entre los aislados de M. laxa. No se encontraron apotecios de M. laxa ni de M. fructicola en el suelo de ninguno de los tres huertos, pero se produjeron apotecios de M. fructicola en el laboratorio. La variabilidad genetica de M. fructicola se podria mantener por reproduccion sexual y/o recombinacion parasexual. Posteriormente, se evaluo el comportamiento diferencial de M. laxa y M. fructicola frente a los principales grupos de fungicidas sistemicos (bencimidazoles, dicarboximidas e inhibidores de la demetilacion) utilizados en el control de la podredumbre parda en Espana. En primer lugar se caracterizaron las dinamicas de resistencia a fungicidas y fitness de la poblacion de M. fructicola, el agente causal mas reciente de la podredumbre parda en el Valle del Ebro. Para ello, se determinaron la resistencia a metiltiofanato (TM), iprodiona (I), y ciproconazol (CPZ), la fitness y la competencia in vitro de 535 aislados de campo recogidos durante el periodo 2006–2010. Se encontro que: (a) mas del 95% de los aislados de M.fructicola resultaron altamente resistentes a TM, (b) mas del 50 % de los aislados de M. fructicola resultaron resistentes a I, manteniendose estas resistencias a lo largo de los cinco anos de muestreo, y (c) algunos aislados resistentes a CPZ en la poblacion a partir de 2008. Se identificaron cinco diferentes fenotipos de resistencia (R) y/o sensibilidad (S) a fungicidas, comprobandose tambien que la poblacion contiene aislados multirresistentes. Ademas, se determino que los aislados resistentes a fungicidas presentaban altos niveles de fitness parasitica en fruta y flor y alta competencia. Del mismo modo, se estudiaron las dinamicas de resistencia, sensibilidad, fitness y competencia de aislados de campo de M. laxa recogidos en huertos de melocotonero y nectarina. Para ello, 788 aislados fueron recogidos al azar de 121 huertos diferentes en el Valle del Ebro entre 2006 y 2010. En la poblacion de M. laxa se encontro: (a) un incremento progresivo desde 2007 de la frecuencia de los aislados resistentes a TM, (b) dos subpoblaciones que presentaban una reducida sensibilidad a I constantes a lo largo del tiempo, y (c) sensibilidad a ciproconazol en toda la poblacion estudiada. Se identificaron cuatro fenotipos diferentes de resistencia y/o sensibilidad a fungicidas, comprobandose tambien que la poblacion de M. laxa contiene aislados multirresistentes. Si bien la fitness y la competencia de los aislados resistentes fueron altas, se observo una perdida de fitness y una menor competencia de los aislados resistentes a iprodiona frente a los aislados sensibles. Estos hallazgos sugieren que la mayor resistencia de los aislados de M. fructicola a TM, I, y CPZ puede estar contribuyendo a modificar la frecuencia de las especies de Monilinia spp. en el Valle del Ebro, seleccionandose ademas poblaciones resistentes. Estos hallazgos sugieren que las estrategias para el control de la podredumbre parda en el Valle del Ebro deben ser revisadas, teniendo en cuenta el comportamiento diferencial de las dos especies frente a los grupos de fungicidas estudiados. Por ultimo, despues de quince anos tras el primer aislamiento de M. fructicola en Europa y a punto de alcanzar una decada tras la primera deteccion en Espana, se ha llevado a cabo un estudio de diversidad genetica sobre la poblacion de M. fructicola resistente a becimidazoles, dicarboximidas e inhibidores de la demetilacion. Se realizo un estudio de diversidad genetica sobre 110 aislados de M. fructicola que presentaban diferentes fenotipos de resistencia a fungicidas. Los resultados mostraron unos niveles de variabilidad inesperadamente altos para un patogeno introducido hace relativamente poco en Espana. Ademas se encontraron evidencias de recombinacion entre fenotipos resistentes, hecho que podria haber permitido que los aislados de M. fructicola combinaran resistencias a fungicidas que se habian desarrollado de manera independiente. La recombinacion (bien por reproduccion sexual y/o anastomosis y/o heterocariosis), las mutaciones (resistencia a fungicidas) y una rapida expansion de la poblacion tras un cuello de botella, se sugieren como las principales fuerzas evolutivas asociadas a la alta variabilidad de la poblacion. ABSTRACT Monilinia laxa and M. fructigena were known until 2006 as causal agents for blossom blight and fruit brown rot in Spain. Since 2006, a new species M. fructicola, has been detected in orchards in the Ebro Valley, one of the most important stone fruit producing region in Spain. Different factors, such as morphological and pathogenic, besides the telemorph stage described for this species and a greater propensity to develop resistance to fungicides, have allowed a quick adaptation of this pathogen in other regions worldwide. The purpose of this thesis was to determine the relative frequency of these three species as a result of the new introduction and to validate the assumptions made above. Transversely along this work, we have studied the different evolutionary forces involved in the adaptive success of M. fructicola in Spain. First of all, seventeen field surveys were done in four commercial orchards during six consecutive fruit growing seasons from 2006 until 2011 in order to determine the current frequencies of occurrence of M. laxa, M. fructigena, and M. fructicola and their relative contributions to postharvest brown rot in peaches and nectarines in the Ebro Valley. The relative frequencies of occurrence of Monilinia spp. were determined on three sources of primary inoculum and on three sources of secondary inoculum. The major relative frequencies of Monilinia spp. were significantly recorded (P=0.05) from mummified fruit on the trees (approx. 42 %) and 7-day-old harvested fruit with brown rot (32%), followed by that recovered from mummified fruit on the orchard bed (14 %), pruned branches on the orchard bed (8 %) and latent infections of immature fruit (3 %). We found that: (a) the relative frequency of M. fructicola has increased over the years to coexist on the same level as at the time M. laxa, (b) M. fructigena is no longer a cause of brown rot in harvested peaches, (c) a progressive reduction in the time of the first appearance of Monilinia airborne conidia (r=−0.30, P=0.003), and the time of the first latent infection (r=−0.44,P=0.0001) was detected along years after correlation analysis, and (d) these displacements are not associated with an increased incidence of brown rot disease. The M. fructicola increase was due to its significantly increased presence in 7-dayold harvested fruit with brown rot (r=0.73, P=0.0009), in latent infections of immature fruit (r=0.68, P=0.002), on pruned branches on the orchard bed (r=0.56, P=0.018), and on mummified fruit sampled on the trees (r=0.53, P=0.03). This progressive increase was accompanied by a progressive reduction in the relative frequency of occurrence of M. laxa in 7-day old harvested fruit with brown rot (r=−0.55, P=0.021) and M. fructigena on mummified fruit sampled on the trees (r=−0.51, P=0.03). In order to determine the characteristics that may be related to the species displacement, we studied the capacity to generate new genotypic combinations of M. fructicola under laboratory conditions. The morphology and parasitic ability from ten field isolates of M. fructicola and M. laxa collected from three different orchards in the valley, and sampling from five different lesions were studied. Nitrate-non-utilising (nit) mutants were generated in order to test the isolates for vegetative compatibility which was done by assessing their colony growth when cultured singly or in pairs on media that contained different nitrogen sources. For the M. fructicola isolates, five vegetative compatibility groups (VCGs) were identified using the nit mutants and six VCGs were identified when they were grown on potato dextrose agar dishes. In all instances, the vegetatively compatible M. fructicola isolates came mainly from the same orchard. Only one VCG displays the same morphological and competition characteristics. No VCGs were identified among the M. laxa isolates. We did not find any apothecia of M. laxa and M. fructicola isolates in the soil of the three orchards, but we were able to produce apothecia of M. fructicola in the laboratory. Our finding of sexual reproduction and VCGs in the M. fructicola isolates suggests that the genetic variability of M. fructicola could be maintained by sexual and/or parasexual recombination. Subsequently, the differential behavior of M. laxa and M. fructicola against major systemic fungicide groups (benzimidazoles, dicarboximides and demethylation inhibitors) used to control brown rot in Spain were evaluated. Firstly, the dynamics of fungicide sensitivity and fitness of M. fructicola population, the most recent species causing brown rot in the Ebro Valley, were characterized by determining their resistance, fitness, and in vitro competitiveness to thiophanate-methyl (TM), iprodione (I), and cyproconazole (CPZ) in 535 field isolates recovered over the 2006–2010 period. We found that: (a) more than 95% of the M.fructicola isolates are high TM-resistant, (b) more than 50 % of the M. fructicola isolates are I resistant and these frequencies of occurrence did not change during our 5-year survey, and (c) a few CPZ resistant isolates have been also detected in population since 2008. We identified five different fungicide resistant (R) and/or fungicide-sensitive (S) phenotypes and found that our study population contains multiple fungicide-resistant isolates. Moreover, these fungicide resistant isolates display high parasitic fitness on fruit and flowers and high competitiveness. In the same way, the dynamics of fungicide sensitivity, resistance, fitness, and competitiveness of M. laxa field isolates in peach and nectarine orchards were further studied. The investigation comprised 788 isolates, which were randomly collected from 121 peach orchards in the Ebro Valley during the 2006 to 2010 growing seasons. M. laxa population showed (a) a progressive increase of the frequency of thiophanate-methylresistant isolates since 2007, (b) two subpopulations of isolates which showed iprodione reduced sensitivity and did not increase their frequencies over time and (c) no cyproconazole-resistant isolates. We identified four different fungicide resistant (R) and/or fungicide-sensitive (S) phenotypes and found that our study population contains multiple fungicide-resistant isolates. Moreover, these fungicide resistant isolates display high parasitic fitness on fruit and flowers and high competitiveness, excepting the IR isolates which showed lack of fitness and reduced competitiveness. The higher M. fructicola resistance to TM, I, and CPZ of could be contributing as another factor on changing the frequency of occurrence of the three Monilinia species in the Ebro Valley while resistant population is being selected. These findings suggest that the current brown rot management strategies in the Ebro Valley should be revised in accordance to differential beahaviour of Monilinia spp. against the studied fungicides. Lastly, after fifteen years since first isolation of M. fructicola in Europe and close to a decade after the first detection in Spain, a 5-year genetic diversity analysis has been conducted on a population of M. fructicola resistant to benzimidazoles, dicarboximides, and demethylation-inhibitors. A genetic diversity study was carried out on 110 M. fructicola isolates belonging to different fungicide resistance phenotypes. Results showed an unexpected high variability for a presumably quite recently introduced pathogen. Moreover, there is evidence that indicated recombination among fungicide resistance phenotypes, which might have allowed M. fructicola to combine resistances to fungicides which had been developed independently. Recombination (by sexual reproduction and/or hyphal anastomosis and/or heterokaryosis), mutations leading to fungicide resistance, and rapid expansion of the founder population after a bottleneck are thus suggested as the main evolutionary forces associated to the high population variability.