Tesis:
Roles of C1A peptidases during barley leaf senescence mediated by abiotic stresses
- Autor: VELASCO ARROYO, Blanca
- Título: Roles of C1A peptidases during barley leaf senescence mediated by abiotic stresses
- Fecha: 2017
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: http://oa.upm.es/45478/
- Director/a 1º: DÍAZ RODRÍGUEZ, Isabel
- Director/a 2º: MARTÍNEZ MUÑOZ, Manuel
- Resumen: Protein breakdown and mobilization from old or stressed tissues, such as leaves, to growing and sink organs, such as grains or tubers, are some of the metabolic features associated with leaf senescence, essential for nutrient recycling. Senescence may be naturally activated by endogenous signals and/or modified by the prevalence of abiotic/biotic stresses, as a survival strategy. Protein breakdown in senescing leaves involves many plastidial and nuclear proteases, regulators, different subcellular locations and a dynamic protein traffic to ensure transformation of high molecular weight proteins into transportable and useful hydrolyzed products. C1A cysteine proteases are the most abundant key players responsible for the proteolytic activity during leaf senescence. Besides, cystatins, as specific modulators of C1A protease activities, exert a regulatory role along the process. In barley (Hordeum vulgare), the whole gene family members of C1A cysteine proteases and cystatins have been identified. Elucidating the role of barley C1A proteases in response to abiotic stresses is crucial due to their impact on plant growth and grain yield and quality. Darkness and nitrogen starvation treatments were used to induce leaf senescence in barley. Both abiotic stresses strongly induced the expression of the HvPap-1 gene encoding a cathepsin F-like protease. Morphological changes presuming chloroplast dismantling designated darkness as an ideal stressor for inducing and analyzing senescence. Differences in biochemical parameters and C1A gene expression and protein accumulation among wild-type and transgenic barley plants over-expressing or silencing this gene were detected under the stress. Besides, a lifespan-delayed phenotype of HvPap-1 silenced lines was evidenced, indicating a functional role for this protease along the senescence process. Proteolysis is likewise essential throughout the mobilization of storage proteins in barley grains during germination. Manipulation of the proteolytic machinery could enhance grain yield and quality through alterations along these stages. Transgenic barley plants silencing or over-expressing HvPap-1 showed differential accumulation of starch, proteins, and free amino acids in the grain. The phenotype displayed by silencing HvPap-1 lines, showing a drastic delay in germination, was particularly striking. Alterations in the proteolytic activities associated with changes in the expression levels of several C1A proteases were also detected. Similarly, down-regulating Icy-2, encoding one of the proteinaceous inhibitors of the studied cathepsin F-like protease, also brought about important effects on grain filling. The cooperative role of cystatins and their functional relationship with cysteine proteases have been highlighted in the current study by the enhanced/reduced tolerance of plants silencing phytocystatins towards drought. Two barley phytocystatins, HvCPI-2 and HvCPI-4, were induced by this stress. Alterations in the proteolytic patterns by silencing these cystatins were concomitant with modifications in the expression of target proteases. As a result, accelerated or delayed leaf senescence, depending on the silenced cystatin, was exhibited. Results support the potential use of these plants to modulate plant responses facing abiotic stress and, at the same time, to maintain or even increase crop yields under the evidenced climate change framework According to data reported in this thesis, manipulation of C1A proteases-cystatins interactions in barley has the potential to modulate sensitivity towards specific abiotic stresses through modifications over established developmental leaf senescence programs. In addition, the in vivo implication of this proteolytic network during remobilization of stored compounds along barley grain germination is demonstrated. As a general remark, caution should be taken when designing related biotechnological tools since the plant tries to compensate the genetic modifications by modulating the expression of some other proteases or inhibitors. RESUMEN La degradación y movilización de proteínas desde tejidos maduros o sometidos a estrés, como las hojas, hasta los órganos en desarrollo o sumidero, como los granos de los cereales, son procesos metabólicos inherentes a la senescencia foliar. Los programas de senescencia se activan tanto en respuesta a señales endógenas como a estreses abióticos y bióticos como estrategia de supervivencia. La proteólisis en hojas senescentes implica multitud de proteasas de origen nuclear y plastidial, reguladores, diversas localizaciones subcelulares, así como un tráfico dinámico cuyo fin es asegurar la transformación de proteínas de alto peso molecular en productos hidrolizados que puedan transportarse y reutilizarse. La familia C1A de cisteín-proteasas engloba un buen número de enzimas responsables de la actividad proteolítica asociada a la senescencia foliar. Además, las cistatinas, inhibidores específicos de dichas proteasas, ejercen un papel regulador durante este proceso fisiológico. En cebada (Hordeum vulgare), las familias completas de proteasas C1A y cistatinas han sido identificadas. Dilucidar el papel funcional de las proteasas C1A de cebada en respuesta a estreses abióticos es esencial, debido a su impacto sobre el crecimiento de las plantas y la alteración del rendimiento y calidad del grano. Los tratamientos de oscuridad y de carencia de nitrógeno se utilizaron para inducir senescencia foliar en cebada. Ambos estreses indujeron claramente la expresión del gen HvPap-1, que codifica una proteasa tipo catepsina F. Cuando se compararon plantas control frente a líneas transgénicas de sobrexpresión y de silenciamiento para este gen en oscuridad, se observaron alteraciones significativas en parámetros bioquímicos, en patrones de expresión de genes de proteasas C1A, así como en el contenido proteico. Por otro lado, el fenotipo “stay-green” de las líneas de silenciamiento evidenció una vida útil más prolongada en estas plantas, demostrando la implicación funcional de esta proteasa a lo largo del proceso de senescencia. La proteólisis es asimismo esencial para la movilización de proteínas de reserva del grano durante la germinación. La manipulación de la maquinaria proteolítica durante este proceso fisiológico podría tener un efecto de mejora sobre la calidad del grano y el rendimiento del cultivo. Las líneas transgénicas de sobreexpresión y silenciamiento del gen HvPap-1 mostraron una acumulación diferencial de almidón, proteínas y amino ácidos en la semilla. El fenotipo de los granos de las líneas silenciadas evidenció un claro retraso en el proceso germinativo. También se observaron alteraciones en las actividades proteolíticas, asociadas a las variaciones en los niveles de expresión de genes C1A. De forma paralela, al silenciarse el gen Icy-2 que codifica uno de los inhibidores de la catepsina F estudiada, se observaron efectos en relación con el llenado y calidad del grano. La interacción y la implicación funcional de cisteín-proteasas y cistatinas en cebada se ha constatado en este estudio, tal y como se infiere de la tolerancia alterada frente a sequía en las líneas de silenciamiento de cistatinas. Dos fitocistatinas, HvCPI-2 y HvCPI-4, se indujeron específicamente por dicho estrés. Las alteraciones en los patrones proteolíticos al silenciar estas cistatinas fueron paralelas a las variaciones en la expresión de genes de sus proteasas diana. En función de la cistatina silenciada, se apreció un retraso o una aceleración en la senescencia. Estos resultados apoyan el uso de estas líneas con el objetivo de modular las respuestas a estreses diversos y mantener, o incluso incrementar, los rendimientos en el marco evidente del cambio climático. De acuerdo con los resultados obtenidos, la manipulación de las interacciones entre proteasas C1A y cistatinas en cebada permitiría modular la sensibilidad frente a estreses abióticos concretos en base a modificaciones sobre los programas de senescencia endógenos. Se confirma asimismo, la importancia in vivo de esta compleja red proteolítica durante la germinación. Como observación general, cuando se diseñen estrategias biotecnológicas basadas en estos mecanismos moleculares se han de considerar los efectos de compensación derivados de la expresión de otros inhibidores y/o proteasas de la planta.