Tesis:
Dissecting the role of Arabidopsis thaliana AMIDASE 1 in auxin biosynthesis
- Autor: SÁNCHEZ PARRA, Beatriz
- Título: Dissecting the role of Arabidopsis thaliana AMIDASE 1 in auxin biosynthesis
- Fecha: 2017
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA
- Acceso electrónico: http://oa.upm.es/46335/
- Director/a 1º: POLLMANN, Stephan
- Resumen: Las plantas han ido evolucionando a lo largo del tiempo para sobrevivir y adaptar su crecimiento y desarrollo a los cambios medioambientales. Esta propiedad adaptativa la han llevado a cabo gracias a su capacidad de detectar las señales que les llegan del exterior y que posteriormente procesan y traducen en adecuados cambios fisiológicos. Como cualquier organismo vivo, las plantas usan hormonas que, en mínimas concentraciones, son las encargadas de controlar esos cambios fisiológicos. Entre dichas fitohormonas, destacan las auxinas, ya que se las considera las principales moléculas reguladoras del desarrollo vegetal. Y a su vez, dentro de las auxinas destaca el ácido indol-3-acético (IAA), que es la auxina más común que podemos encontrar en la naturaleza. Hoy día, se conoce prácticamente todo de la función que desempeña el IAA en las plantas: interviene en la regulación del crecimiento vegetal; en el desarrollo de las raíces y del embrión; en la formación de órganos vegetales; en la diferenciación de tejido vascular e influye en el crecimiento de la planta atendiendo a las señales medioambientales recibidas (Davies 2010). Sin embargo, cómo es la biosíntesis del IAA no está del todo esclarecida hoy día. Actualmente, se conocen diferentes rutas enzimáticas que conducen a su producción: la ruta del ácido indol-3-pirúvico (IPA); la ruta del indol-3-acetaldoxima (lAOx) y la del indol-3- acetamida (IAM). No obstante, actualmente faltan aún por confirmar y conocer varias reacciones de dichas rutas. Por ejemplo, en la ruta del IAM la monooxigenasa involucrada en llevar a cabo la primera reacción enzimática, catalizando la conversión del triptófano (Trp) en IAM, no ha sido aún identificada. Sin embargo, la segunda enzima, AMIDASA 1 (AMI1), que transforma el IAM en IAA, fue identificada hace algunos años (Pollmann, Neu and Weiler 2003). En Arabidopsis thaliana, la mayoría del IAM se origina de la ruta del lAOx, que es específica de la familia de plantas Brassicaceae (Sugawara et al. 2009). Esto, posiblemente restringe la actividad de AMI1 a esta familia vegetal. Por otro lado, la presencia de IAM ha sido detectada en un número de plantas diferentes, incluyendo a las algas marinas (Pollmann et al. 2002; Stirk et al. 2009; Sugawara et al. 2009). Por todo esto y con el objetivo de elucidar algunas de las reacciones desconocidas en la biosíntesis del IAA, hemos centrado nuestra atención en el análisis y caracterización de los procesos relacionados con AMI1. Primeramente, el estudio filogenético y el subsecuente estudio enzimático de varias amidasas vegetales han demostrado que la función enzimática de AMI1 y sus enzimas homólogas está muy bien conservada, y que además, parece ser esencial para las plantas, lo que es confirmado por la amplia distribución que presentan enzimas homólogas a AMI1, en el Reino Vegetal. Además, el uso de las líneas de ganancia y pérdida de función para AMI1 ha confirmado que su participación en la conversión de IAM en IAA, previamente detectada in vitro, también tiene lugar in vivo. Por otro lado, análisis por qRT-PCR y ensayos histoquímicos han ampliado nuestro conocimiento sobre la relación de AMI1 y el resto de intermediarios metabólicos y componentes moleculares que constituyen la compleja red de los procesos biosintéticos de IAA. Como uno de nuestros principales resultados, destaca la regulación dependiente de metabolitos de la expresión génica de AMI1, principalmente llevada a cabo por IAM e IAA. Donde IAM tiene un efecto represor sobre AMI1, mientras que IAA lo induce. La última observación ha sido sustanciada por la generación y el análisis de nuevas líneas mutantes: o/77/'l-2/DR5:GUS; pAMIl:GUS/YUC9ox, pAMIl:GUS/r íyl ; amil-2/rtyl. Los resultados obtenidos con dichas líneas han sugerido un importante papel de AMI1 en la homeostasis de auxinas, el desarrollo del embrión y maduración de la semilla en Arabidopsis. También, el uso de experimentos de microarray con las diferentes líneas de AMI1 (amil; AMIlind) han señalado que la principal función de AMI1 es la de controlar el pool endógeno de IAM más que la de producir auxinas. En este contexto, AMI1 podría estar indirectamente relacionada con la regulación de las respuestas de estrés vegetal, desarrollo floral y percepción de azúcares. Finalmente, y debido a la importancia de ir completando las rutas de biosíntesis de IAA, en este trabajo se ha buscado a un candidato molecular que pudiera estar catalizando la conversión de lAOx o Trp en IAM. Utilizando los resultados de los experimentos transcriptómicos realizados, pudimos detectar un posible candidato para dicha reacción: CYP71B22. Y aunque aún falta concluir más sobre la actividad de CYP71B22, nuestros primeros estudios han dado a entender que podría ser la enzima idónea para llevar a cabo dicha reacción. ABSTRACT Over the course of time plants have evolved sophisticated mechanisms to adjust their growth and development to environmental changes. This adaptive property is attributed to their capacity of detecting environmental signals that are subsequently processed and translated into appropriate physiological changes. As any other living organism, plants use hormones that, in very little concentrations, are in charge of controlling these physiological changes. From all the phytohormones, auxins are considered as the main group of molecules to regulate plant growth. Within this group, indol- 3-acetic acid (IAA) is the most common naturally occurring auxin in plants. Nowadays, it is known that IAA has essential roles in regulating plant growth, including embryo and root patterning, organ formation, vascular tissue differentiation and growth responses to environmental cues (Davies 2010). However, the current knowledge on how IAA is produced still remains incomplete. It is assumed that the following enzymatic pathways contribute to the biosynthesis of IAA: the indole-3-pyruvic acid (IPA)-pathway, the indole-3-acetaldoxime (lAOx)-route and the indole-3- acetamide (lAM)-pathway. However, there are many reactions that are still elusive in these pathways. For instance, the monooxygenase involved in the initial reaction step of the IAMpathway, which catalyses the conversion of tryptophan (Trp) to 1AM, remains unidentified, while the second enzyme, AMIDASE1 (AMU), which transforms 1AM into IAA has been identified a number of years ago (Pollmann, Neu and Weiler 2003). In Arabidopsis thaliana, the majority of 1AM originates from the lAOx-pathway that is specific to Brassicaceae (Sugawara et al. 2009). This possibly restricts AMU action to this plant family. The AMU activity has neo-functionalized over the course of evolution according to the metabolic properties of Arabidopsis. On the other hand, the occurrence of 1AM has been detected in a number of different kind of plants, including seaweeds (Pollmann et al. 2002; Stirk et al. 2009; Sugawara et al. 2009). Hence, with the aim of elucidating some of the open gaps in IAA-biosynthesis, we focused our attention on the analysis and characterization of AMIl-related processes. Firstly, the phylogenetic analysis and the subsequent enzymatic study of selected plant amidases have demonstrated that the enzymatic function of AMU and its homologous enzymes is very well conserved, and seemingly likely essential for plants, which is highlighted by the wide distribution of AMIl-like enzymes in the plant kingdom. In addition, the use of loss- and gain-of-function lines for AMU has confirmed its participation in the conversion of 1AM to IAA in vivo. On the other hand, qRT-PCR analysis and histochemical assays have broadened our understanding of the relationship of AMU with the rest of the metabolic intermediates and molecular components that are forming part in the complex network of IAA biosynthetic processes. As one of our principal findings, we detected a metabolite-dependent regulation of AMU gene expression, principally driven by 1AM and IAA. Here, 1AM is repressing AMU gene expression, whereas IAA induces it. The latter observation has been substantiated by the generation and analysis of novel mutant lines: o/77/'l-2/DR5:GUS; pAMIl:GUS/YUC9ox, pAMIliGUS/rtyl ; amil-2/rtyl. All together, the obtained results suggested an important role for AMU in auxin homeostasis, embryo development and seed maturation. Microarray experiments utilizing different mutant lines of AMU (amil; AMIlind) have furthermore underlined that the main function of AMU is rather the control of the endogenous 1AM pool of plants, than the production of auxin. In this context, AMU could be indirectly related with the regulation of plant stress responses, floral development and sugar sensing. Finally, striving for the complete elucidation of the IAM-dependent auxin biosynthesis route, we sought in this thesis for a molecular candidate to catalyse the conversion of lAOx or Trp into 1AM. Using transcriptomics and forward genetics approaches, we were able to identify a very promising candidate for this task, CYP71B22. It is still to draw a final conclusion on the activity of CYP71B22, but all of our experiments performed thus far propose this enzyme as the best candidate for this reaction.