Tesis:
Epidemiología y control de la podredumbre parda del melocotón en postcosecha
- Autor: GARCÍA BENÍTEZ, Carlos
- Título: Epidemiología y control de la podredumbre parda del melocotón en postcosecha
- Fecha: 2017
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: http://oa.upm.es/47130/
- Director/a 1º: CAL Y CORTINA, María Antonieta de
- Resumen: La podredumbre parda es la principal enfermedad de la fruta de hueso que afecta a melocotones y nectarinas. Los agentes causales de la enfermedad en España son tres especies fúngicas del género Monilinia: M. fructicola (Winter) Honey, M. fructigena (Aderhold and Ruhland) y M. laxa (Aderhold and Ruhland) Honey. La enfermedad provoca pérdidas tanto durante la pre-cosecha, causando marchitez de yemas y flores y podredumbre de frutos, como durante la post-cosecha, donde la incidencia de la enfermedad tiene una mayor importancia y causa de media entre un 10 y un 30 % de podredumbre pudiendo alcanzar más del 80 % de pérdidas en aquellos años favorables al desarrollo de la enfermedad y en variedades tardías. Se han estudiado en profundidad la etiología, la epidemiología y el control de la enfermedad durante la pre-cosecha, pero no durante la post-cosecha. El propósito de esta tesis es estudiar la podredumbre parda durante la post-cosecha incidiendo en el estudio de las infecciones latentes en este periodo, que son una de las causas principales de la incidencia de la enfermedad en post-cosecha. La infección de la fruta comienza cuando las conidias germinan en la superficie de la fruta dando lugar a tubos germinativos y/o apresorios que luego penetran el fruto. Se sabe que la fruta se vuelve más susceptible a medida que madura, sin embargo la relación entre los procesos de infección, la madurez de la fruta y las condiciones ambientales no está bien definida. Por ello se investigó como afectaban a la formación de tubos germinativos y apresorios de M. fructicola y M. laxa: (a) extractos de piel de melocotón maduro e inmaduro, (b) diferentes temperaturas y (c) diferentes humedades relativas; prestando especial atención a las condiciones ambientales presentes durante la post-cosecha. Se encontró que el mayor número de tubos germinativos se producía al incubar M. laxa o M. fructicola en medios de cultivo que contenían extractos de piel de melocotón maduro. Mientras que el mayor número de apresorios aparecía al incubarlos en medios de cultivo que contenían extractos de piel de melocotón inmaduro. Las conidias de M. laxa germinaron mejor que las de M. fructiola a bajas temperaturas. La formación de tubos germinativos y apresorios por Monilinia spp. se vio influenciada por los procesos de post-cosecha. M. laxa formaba un mayor número de tubos germinativos que M. fructicola cuando las conidias se incubaron a 100 % de humedad relativa en las condiciones de postcosecha, este número aumentaba tras 3 días consecutivos de refrigeración. El número de apresorios formados por M. fructicola y por M. laxa también aumentaba tras 3 días consecutivos de refrigeración. La germinación tanto de M. fructicola como de M. laxa durante las condiciones de post-cosecha a 60 % de humedad relativa fue insignificante. Se concluye que las diferentes capacidades de germinación y formación de apresorios de M. fructicola y M. laxa a bajas temperaturas, confieren a M. laxa una ventaja competitiva sobre M. fructicola durante la refrigeración y almacenamiento en postcosecha. Tras la germinación de las conidias, Monilinia spp. penetra la superficie del fruto y coloniza los tejidos del mismo, la mayoría de los hongos necrótrofos se ayudan de fitotoxinas y/o enzimas líticas para facilitar estos procesos. Existe muy poca información sobre las enzimas líticas de Monilinia y ninguna sobre sus fitotoxinas, por lo que se decidió identificar y caracterizar las fitotoxinas y enzimas líticas producidas por las tres especies de Monilinia. Se detectó actividad fitotóxica sobre círculos de nectarina en los extractos con butanol del zumo de nectarinas infectadas con M. fructicola, M. fructigena o M. laxa y también en el extracto con acetato de etilo del zumo de nectarinas infectadas con M. fructicola. Los extractos con actividad fitotóxica se fraccionaron mediante HPLC para delimitar las moléculas fitotóxicas observando que únicamente una de las fracciones (tiempo de retención de entre 3,5 y 4,5 min) tenía actividad fitotóxica sobre círculos de nectarina. Al analizar los metabolitos fitotóxicos existentes entre esos tiempos de retención con un espectrómetro de masas, se determinó que tenían un peso molecular comprendido entre 329 y 387 g mol-1. Las tres especies de Monilinia presentaron actividad enzimática de α-glucosidasas, pectin-liasas, polygalacturonasas, proteasas y xilanasas en medio de cultivo. Adicionalmente, M. fructicola y M. laxa presentaron actividad enzimática de cutinasas en medio de cultivo. Ninguna de las especies tenía actividad enzimática de β- glucosidasas, necesaria para degradar hemicelulosa y callosa en medio de cultivo. Se concluye que Monilinia spp. utiliza tanto fitotoxinas como enzimas líticas para penetrar y colonizar los frutos. Se precisan estudios adicionales para determinar la estructura química de las fitotoxinas identificadas y determinar el papel que tienen cada una de las actividades enzimáticas en la virulencia de Monilinia spp. Tras la penetración de la superficie de los frutos se sabe que el micelio de Monilinia coloniza los tejidos del fruto. Sin embargo, no existe mucha información histológica acerca de cómo se produce esta colonización tanto en infecciones visibles como en infecciones latentes. Por ello se estudió la microanatomía de nectarinas con infecciones latentes y visibles causadas por M. fructicola. Para estudiar las infecciones visibles se incubaron nectarinas maduras inoculadas a 25 ºC durante 0, 24, 48, 72 y 96 h en oscuridad. Para estudiar infecciones latentes se incubaron nectarinas maduras inoculadas primero a 25 ºC durante 24 h y después, tras una desinfección superficial, a 4 ºC durante 72, 144, 218 y 288 h en oscuridad. Al terminar los distintos periodos de incubación se diseccionaron muestras de tejidos de las zonas de inoculación para su examen con el microscopio óptico de campo claro y con el microscopio electrónico de transmisión. No se observaron síntomas superficiales en los frutos con infecciones latentes durante las 288 horas de incubación. Durante la infección latente M. fructicola primero colonizaba las cavidades subestomáticas y después se expandía colonizando lateralmente las células subepidérmicas y causando un colapso progresivo de las células epidérmicas sin extenderse al mesocarpo. En nectarinas con infección visible aparecían síntomas de podredumbre parda tras 24 h de incubación y a las 48 horas las capas superiores de células epidérmicas empezaban a colapsarse. Tras lo cual la enfermedad progresaba mostrando (a) colonización inter e intracelular de células epidérmicas y mesocárpicas con hifas finas y gruesas, (b) colapso y rotura de células epidérmicas y mesocarpicas, (c) aparición de cavidades lisogénicas en las células del mesocarpo, (d) degradación de la cutícula y la epidermis, y (e) esporulación de M. fructicola. Es de especial interés haber demostrado que las infecciones latentes de Monilinia permanecen activas, dado que se produce una colonización lenta y progresiva de las células subcuticulares. Las técnicas de genética molecular, como la trasnsformación fúngica permiten profundizar y ampliar el conocimiento de la patogénesis tanto a nivel molecular como histológico. Por ello se probaron tres métodos de transformación (CaCl2/Polietilenglicol, electroporación y acetato de litio) en dos aislados de M. fructicola y dos aislados de M. laxa y se construyeron vectores de transformación que contenían el gen de resistencia a fleomicina como gen de selección y el gen de una proteína fluorescente (GFP o mCherry). Ninguno de los protocolos dio lugar a transformantes en Monilinia spp., pero sí que se logró transformar P. rubens con los vectores de transformación construidos. Las conidias, hifas y esporas de M. fructicola y M. laxa tienen un número variable de núcleos, que parecen tener cierto grado de heterocariosis lo que dificulta la obtención de transformantes y mutantes homocarióticos. Para llevar a cabo una buena estrategia de control es necesario conocer la incidencia de podredumbre parda en precosecha, el riesgo de infección en los 30 días previos a la cosecha, los tratamientos de control aplicados en ese periodo y la incidencia de infecciones latentes en los frutos recogidos. Todo lo anterior se puede obtener de manera rápida y sencilla, salvo la incidencia de infecciones latentes. El método de congelación durante la noche (ONFIT por sus siglas en inglés Overnight Freezing Incubation Technique) es el más utilizado para detectar infecciones latentes de podredumbre parda, pero se requieren de 7 a 9 días para su detección. Para resolver este problema se aplicó un método basado en qPCR con objeto de (i) detectar infecciones latentes de podredumbre parda en flores y frutos de nectarino y (ii) identificar las especies de Monilinia en dichas infecciones. Para aplicar este método se indujeron infecciones latentes de forma artificial en flores y frutos de nectarino con 10 aislados de M. fructicola, 8 aislados de M. fructigena y 10 aislados de M. laxa. Las flores con infecciones latentes artificiales causadas por M. fructicola tenían mayor concentración de ADN fúngico que las que se infectaron con M. fructigena y M .laxa. Sin embargo había mayor concentración de ADN en el mesocarpo de frutos con infecciones latentes artificiales causadas por M. laxa que en aquellos en los que éstas estaban causadas por M. fructicola. En conclusión el método basado en qPCR era más sensible, fidedigno y rápido que el método ONFIT para la detección de infecciones latentes de podredumbre parda, lo que demuestra su utilidad para la detección temprana del patógeno, tanto para su aplicación en estrategias de control como para la detección de las distintas especies de Monilinia en los países donde alguna de ellas sea un patógeno de cuarentena. Para asegurar la reproducibilidad del método de detección de infecciones latentes mediante qPCR, se llevó a cabo un ensayo internacional colaborativo. En este ensayo se determinó la sensibilidad y especificidad del método qPCR de detección de pequeñas concentraciones de ADN (infecciones latentes) en diferentes termocicladores de tiempo real, en 5 laboratorios diferentes y con una metodología común. La validación incluyó un análisis de la precisión, especificidad analítica, sensibilidad analítica y reproducibilidad, de acuerdo a las definiciones de la Organización Europea de Protección de Plantas (EPPO) PM7/98. Todos los equipos de qPCR detectaron infecciones latentes y muestras de micelio de Monilinia con las dos sondas hidrolíticas (que distinguen entre M .fructicola y M. fructigena/M. laxa), mientras que las muestras de flores y frutos sanos no fueron detectadas. La especificidad del método fue consistente entre los distintos laboratorios, pese a los diferentes equipos, sin que ningún laboratorio obtuviese valores “z” en la zona inaceptable. Las muestras de infecciones latentes causadas por M. fructicola fueron correctamente detectadas por todos los laboratorios, pero en algunas de las causadas por M .laxa se produjó detección cruzada como si se tratase de muestras de M. fructicola. La detección cruzada de M. laxa se pudo compensar mediante la implementación de un paso de discriminación alélica, que permite diferenciar entre muestras de M. fructicola y de M. laxa. En conclusión, el ensayo colaborativo demostró la robustez del método y confirmó los resultados obtenidos en la validación propia. Por lo que el método puede usarse para detectar infecciones latentes en flores y frutos asintomáticos de nectarino. Sin embargo, es necesario seguir trabajando en los cebadores y sondas del método para evitar las detecciones cruzadas. Los tratamientos de control durante la post-cosecha están muy restringidos por la normativa Europea. Además, se desconoce el efecto que tienen sobre las infecciones latentes los tratamientos químicos, físicos y biológicos aplicados durante la post-cosecha. Por ello se decidió estudiar e identificar los puntos críticos de activación o promoción del desarrollo de las infecciones latentes durante el proceso de post-cosecha. Para ello, nectarinas desinfectadas superficialmente y congeladas durante 48 h a -20 ºC se sometieron a varias combinaciones de: (a) volcado en agua (si o no), (b) duración del almacenamiento en frío a 4 ºC (0, 1 o 3 días antes del volcado y 0, 3 o 10 días después del volcado) y (c) humedad relativa (75 o 100 %). La activación de las infecciones latentes se producía durante los primeros 9 días cuando las nectarinas se incuban a 25 ºC. Tanto el volcado en agua como la duración del almacenamiento en frío influyeron sobre la activación de las infecciones latentes, mientras que la humedad relativa no tuvo ningún efecto sobre ella. La activación de las infecciones latentes causadas por Monilinia se vio reducida por el volcado en agua y de forma combinada cuando el almacenamiento en frío era inferior a 11 días. Las combinaciones de post-cosecha afectaron a las infecciones latentes causadas por M. fructicola y por M. laxa en la misma medida. Se concluye que tanto el volcado en agua, como el acortamiento del almacenamiento en frío de los frutos son factores clave para limitar la incidencia de las infecciones latentes durante la post-cosecha. ABSTRACT Brown rot is the main disease of stone fruit, affecting peaches and nectarines. In Spain the disease is caused by three fungal species of the genus Monilinia: M. fructicola (Winter) Honey, M. fructigena (Aderhold and Ruhland), and Monilinia laxa (Aderhold and Ruhland) Honey. Brown rot causes losses both before harvest, infecting buds and causing blossom blight and fruit rot, and during postharvest, when the brown rot incidence is most important. In average the disease causes 10 to 30 % of the harvest to be lost, and in extreme cases when the weather conditions are favorable for the disease in late cultivars the losses may reach more than 80 % of the harvest. Disease etiology, epidemiology and control before harvest had been thoroughly studied, but there is little information of those aspects during postharvest. The aim of this doctoral thesis is to study the epidemiology and control of Monilinia spp. latent infections during postharvest as the main causal agent of brown rot incidence in these conditions. The fungal infection process begins when fungal conidia germinate on the fruit surface to produce germ tubes and/or appressoria. The incidence of brown rot increases as fruit approaches maturity. However, the interaction between the fungal infection process, peach maturity, and the environmental conditions is not well understood. Thus, the effects of exposing M. laxa and M. fructicola to: (a) peach skin from mature and immature fruit, (b) several temperatures and (c) several relative humidities (RHs), over their germ tube and appressorial formation were studied, taking special attention to the postharvest environmental conditions. The biggest number of germ tubes was found when M. laxa or M. fructicola was incubated in culture medium which contained a skin extract of mature peaches. In contrast, the biggest number of appressoria was found when M. laxa or M. fructicola was incubated in culture medium which contained a skin extract of immature peaches. M. laxa conidia germinated better than M. fructicola conidia at low temperatures. Germ tube and appressorial formation by Monilinia spp. were influenced by fruit postharvest handling. The number of germ tubes that were formed by M. laxa conidia during postharvest was significantly bigger than that for M. fructicola when the conidia were incubated at 100 % RH, and this number increased after 3 consecutive days of refrigeration. The number of appressoria that were formed by both Monilinia spp. also increased after 3 consecutive days of refrigeration. Negligible or no germination of M. fructicola and M. laxa conidia occurred when the RH was 60 %. We concluded that the dissimilar abilities of M. laxa and M. fructicola to germinate and form appressoria at low temperatures conferred a competitive advantage to M. laxa to survive during fruit postharvest refrigeration and cold storage. After conidial germination Monilinia spp. penetrate the fruit epidermis and colonize the fruit tissues, most necrotrophic fungi use phytotoxins and/or degrading enzymes to facilitate these processes. There is little information about the secreted degrading enzymes by Monilinia spp. and no information at all about their phytotoxins. Hence, secreted phytotoxins and degrading enzymes by the three Monilinia species were identified and characterized. The butanol extract from juice of nectarines inoculated with M. fructicola, M. fructigena, or M. laxa; and the ethyl acetate extract from juice of nectarines inoculated with M. fructicola presented phytotoxic activity on nectarine circles. The extracts with phytotoxic activities were fractioned by HPLC to identify the molecules with phytotoxic activity inside those extracts. Only one (retention time between 3.5 and 4.5 min) out of the total number of fractions of each Monilinia spp. inoculated nectarine juice produced toxic activity on nectarine circles. Phytotoxic metabolites in this retention time were analyzed with the mass spectrometer and they presented a molecular weight between 329 and 387 g mol-1. All three Monilinia species had α-glucosidase, pectin-lyase, polygalacturonase, protease, and xylanase enzymatic activities on culture media. Additionally, M. fructicola and M. laxa had cutinase enzymatic activities on culture media. None of the Monilinia species had β-glucosidase enzymatic activities that serve to degrade hemicellulose and callose on culture media. We conclude that Monilinia spp. uses both phytotoxins and degrading enzymes to penetrate the fruit surface and colonize fruit tissues. Further studies are required to elucidate the complete chemical structure of the toxins from Monilinia spp. and determine the virulence capacity of each enzyme produced by Monilinia spp. It is known that Monilinia mycelia colonize fruit tissues after penetrating the fruit surface. However, little is known about the histologic features of a latent and a visible Monilinia fruit infection. Thus, the microanatomy of nectarines with latent and visible M. fructicola infections was analyzed. Mature nectarines were inoculated with a M. fructicola isolate and incubated at 25 ºC for 0, 24, 48, 72, and 96 h in the dark to analyze visible infections. For investigating the latent infection process, the inoculated nectarines were first incubated at 25 ºC for 24 h in the dark and then, after a fruit surface disinfection, incubated at 4 ºC for 72, 144, 216, and 288 h in the dark. At the end of the incubation period, samples of nectarine tissue were excised from the inoculation points and prepared for light and transmission electron microscopic examinations. No signs of disease were seen on the surface of nectarines with a latent infection over the 288 h incubation period. When the tissue samples of nectarines with latent infections were microscopically examined, M. fructicola colonized the stomata and this stomatal colonization progressively increased over time and was associated with gradual collapse of the epidermal cells and colonization of the subepidermis. In nectarines with visible brown rot, the disease usually appeared after 24 h on the surface and in the uppermost layers of epidermal cells, which began to collapse after 48 h. Subsequently, the diseased tissues of the nectarines displayed (a) colonization of the epidermis and mesocarp by M. fructicola with thin and thick hyphae, (b) collapse and disruption of epidermal and mesocarpic cells, (c) lysogenic cavities in the mesocarp, (d) degradation of the cuticle and epidermis, and (e) M. fructicola sporulation. We found that M. fructicola is active during latent infections because slow and progressive colonization of nectarine subcuticular cells by the fungus occurs. Molecular tools such as fungal transformation, allow furthering the molecular and histologic pathogenic studies. For that reason it was decided to test three different fungal transformation methods (CaCl2/Poly ethylene glycol, electroporation, and lithium acetate) in two M. fructicola and two M. laxa isolates. Expression vectors with the phleomycin resistance gene, as the selection marker, and one fluorescence protein (GFP or mCherry) were constructed. No Monilinia spp. transformants were obtained by any of the tested methods, but P. rubens was transformed with the expression vectors. M. fructicola and M. laxa conidia, hyphae, and protoplasts have a variable number of nuclei and are heterokaryotic, which hinders the fungal transformation of Monilinia spp. A correct postharvest disease control strategy must be based on knowledge obtained before harvest: incidence of brown rot during pre-harvest, risk of infection in the 30 days prior to harvest, control treatments applied during this period, and incidence of latent infection. All easily obtainable except for the incidence of latent infection. The overnight freezing-incubation technique (ONFIT) is a wellestablished method for detecting latent brown rot infections, but it takes between 7 to 9 days. To solve this issue a qPCR-based method was applied to (i) detect a latent brown rot infection in the blossoms and fruit of nectarine trees and (ii) distinguish between the Monilinia spp. in them. For applying this qPCR-based method, artificial latent infections were established in nectarine flowers and fruit using 10 M. fructicola isolates, 8 M. fructigena isolates, and 10 M. laxa isolates. We detected bigger amounts of M. fructicola DNA than M. laxa and M. fructigena DNA in latently infected flowers using qPCR. However, bigger DNA amounts of M. laxa than M. fructicola were detected in the mesocarp of latently infected nectarines. We found that the qPCR-based method is more sensitive, reliable, and quicker than ONFIT for detecting a latent brown rot infection, and could be useful both for control strategies and also in those countries where Monilinia spp. are classified as quarantine pathogens. The Monilinia latent infection detection qPCR method was tested in an inter-laboratory trial (ring test) to ensure its reproducibility. A test performance study involving five laboratories was conducted to validate the sensitivity and specificity of several real-time PCR platforms and laboratories for the detection of low concentration of Monilinia DNA (latent infections), using a common protocol. Validation included test performance in terms of accuracy, analytical specificity, analytical sensitivity, repeatability, and reproducibility as defined by European Plant Protection Organization (EPPO) standard PM7/98. All qPCR platforms detected Monilinia latent infections and mycelia samples with the two hydrolysis probes (that distinguish between Monilinia fructicola and M. fructigena/ M. laxa.), while healthy flowers and fruit samples remained undetected. The method specificity was consistent between different laboratories despite different equipment used, and there were no laboratories with z-scores in the unacceptable region. M. fructicola latent infection samples were correctly detected by all laboratories, but some M. laxa samples were cross-detected as if they were M. fructicola. M. laxa cross-detection could be compensated by including an allelic discrimination step in the qPCR run, which permitted differentiating between M. fructicola and M. laxa samples. In conclusion, the interlaboratory comparison showed the robustness of the developed method and confirmed the in-house validation data. Thus, the method could be used to detect latent infections of Monilinia in asymptomatic nectarine’s fruit and flowers. However, further development of qPCR primers and probes should be undertaken in order to solve the cross-detection problem. Due to European regulation postharvest control treatments are limited. Furthermore, the effect of the chemical, physical and biological control methods over Monilinia latent infections remains unknown. Thus the critical processes inducing latent infection activation during postharvest on the processing plants and fruit distribution have been determined. Disinfected nectarines frozen at -20 ºC for 48 h were subject to different combinations of: (a) dump in water (yes or no), cold storage duration at 4 ºC (0, 1, or 3 days before and 0, 3, or 10 days after dump in water), and (c) relative humidity (75 or 100 % RH). At room temperature latent infection activation takes places during the first 9 days of incubation. Both dump in water and cold storage duration influenced Monilinia spp. latent infection activation, whereas RH had no effect over latent infection activation. Dump in water and combined cold storage durations of less than 11 days reduced latent infection activation. Postharvest handling combinations affected M. fructicola and M. laxa latent infections to the same extent. We conclude that both fruit dump in water and short postharvest handling periods are key factors on reducing Monilinia spp. latent infection activation rates on nectarines.