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Tesis:

Bioinformatic approaches to understand RNA biology in the rice blast fungus

  • Autor: MARCONI, Marco

  • Título: Bioinformatic approaches to understand RNA biology in the rice blast fungus

  • Fecha: 2017

  • Materia: Sin materia definida

  • Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS

  • Departamentos: BIOTECNOLOGIA

  • Acceso electrónico: http://oa.upm.es/47136/

  • Director/a 1º: WILKINSON, Mark D.
  • Director/a 2º: SESMA GALARRAGA, Ane

  • Resumen: El propósito de esta tesis consiste en investigar algunos aspectos del metabolismo del ARN en el hongo Magnaporthe oryzae desde un punto de vista bioinformático, y extrapolar las características claves del ciclo de vida del ARN a todo el reino de los hongos. En el primer capítulo de los resultados hemos conducido el análisis bioinformático de datos de secuenciación masiva de ARN específicos para poly(A) obtenido de la cepa wild-type de M. oryzae y dos mutantes knock-out de dos genes involucrados en la maquinaria de poliadenilación, RBP35 y HRP1. Este ha sido el primer mapeo de los sitios de poliadenilación en M. oryzae, y nos ha proporcionado muchas nuevas informaciones relativamente al estudio de la poliadenilación alternativa. La poliadenilación alternativa es muy frecuente en M. oryzae, y es un mecanismo dinámico regulado por condiciones de estrés nutricional como la falta de carbóno. El análisis de los mutantes también nos indica que RBP35 y HRP1 are profundamente involucrados en la poliadenilación alternativa de un gran número de genes. En el segundo capítulo de los resultados hemos realizado la secuenciación masiva de ARN pequeños en M. oryzae utilizando un nuevo sistema de construcción de librerías. Resulta claro que algún sistema de silenciamiento de ARN está activo en contra de secuencias genómicas repetidas como los retrotransposones y ácidos nucleicos non-genómicos invasivo como los virus. Estos elementos están también sujetos a una modificación post-transcripcional muy extensa nunca observada antes. También hemos confirmado que los genes RBP35 y EXP5 (una carioferina) están implicadas en la regulación de ARN pequeños y posiblemente en alguna ruta de silenciamiento de ARN. En el tercér capítulo de los resultados hemos conseguido la caracterización de un nuevo virus ssRNA de tipo ourmia de M. oryzae, llamado MOLV1. Este virus es específico de la cepa Guy11. Es un virus poliadenilado, y contiene una única ORF que codifica una polimerasa de RNA dependiente de RNA putativa. En el cuarto capítulo de los resultados hemos llevado a cabo la predicción de ortólogos para alrededor de 700 proteínas relacionadas con ARN, en 49 especies. La idea detrás de este análisis consiste en proporcionar un conocimiento exhaustivo relativamente la conservación de procesos asociados a ARN en especies diferentes de M. oryzae. Esta investigación ha desvelado un escenario inesperado; procesos como traducción de ARN y maduración de ARNt están en general bien conservados, mientras otros procesos como la exportación de ARNm y en silenciamiento de ARN exhiben un nivel de conservación variable entre las especies fúngicas consideradas. ---------------------------------------------- ABSTRACT ---------------------------------------------The purpose of this thesis is to investigate various aspects of RNA metabolism in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae using bioinformatic tools and approaches, and to attempt to extrapolate key features of the RNA life cycle over the whole fungal kingdom. In the first results chapter we conducted a bioinformatic analysis of a poly(A)-specific RNA-sequencing dataset obtained from a M. oryzae wild-type strain and knock-out mutants of two genes involved in the polyadenylation machinery, RBP35 and HRP1. This represents the first mapping of polyadenylation sites in the rice blast fungus, and it provided us with several insights regarding regulation of alternative polyadenylation. Alternative polyadenylation is a common feature in the M. oryzae transcriptome; it is a dynamic mechanism regulated by nutrient stresses such as carbon starvation, which provoke the selection of non-canonical poly(A) sites. Mutant analysis also indicate that Rbp35 and Hrp1 are involved in poly(A) site selection in a large number of genes. In the second results chapter we performed the small RNA sequencing of M. oryzae, using a novel library construction protocol. Genomic repetitive sequences such as retrotransposons and non-genomic invasive nucleic acids such as viruses display clear evidence of an RNA silencing mechanism acting in the M. oryzae cell. These same elements are also subject to an extensive post-transcriptional modification not observed in prior studies. We also provide confirmation that RBP35 and EXP5 (a karyopherin) genes are involved in small RNA regulation and possibly in some RNA silencing pathway. In the third results chapter we accomplish the molecular characterization of a novel ssRNA ourmia-like virus from M. oryzae, called MOLV1. This virus is specific to the strain Guy11. It is possibly polyadenylated, and contains a unique ORF coding for a putative RNA-dependent RNA polymerase. In the fourth chapter we carried out the proteome-wide ortholog prediction for approximately 700 RNA-related proteins, in 49 fungal species. The objective of this analysis was to provide a broader understanding of the conservation of RNA-associated processes in fungal species beyond M. oryzae. This evolutionary survey revealed an unexpected scenario; processes like mRNA translation and tRNA maturation are generally well conserved, while other processes like mRNA export and RNA silencing exhibit a variably degree of conservation among the selected fungal species.