Tesis:
Development and characterization of functionalized titanium biomaterials with tunable biological properties
- Autor: REZVANIAN, Parsa
- Título: Development and characterization of functionalized titanium biomaterials with tunable biological properties
- Fecha: 2018
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS DE CAMINOS, CANALES Y PUERTOS
- Departamentos: CIENCIA DE LOS MATERIALES
- Acceso electrónico: http://oa.upm.es/51352/
- Director/a 1º: PÉREZ-RIGUEIRO, José
- Resumen: El titanio y sus aleaciones se encuentran entre los biomateriales de uso más frecuente para la sustitución de tejidos duros. Esta elección viene motivada por su elevada resistencia a la corrosión, sus notables propiedades mecánicas y su excelente biocompatibilidad. La principal característica que distingue al titanio y sus aleaciones del resto de biomateriales metálicos es su módulo elástico, que resulta ser inferior al del resto de dichos biomateriales metálicos y, por tanto, más próximo al módulo elástico del hueso. Estas propiedades hacen que las aleaciones de titanio sean la elección preferida para la fabricación de biomateriales para la sustitución de tejidos duros, especialmente en aquellas aplicaciones que requieren soportar cargar mecánicas. Sin embargo, un inconveniente del uso de titanio como implante óseo es la ausencia de un contacto directo del metal con el hueso adyacente. Así, se encuentra que el implante aparece rodeado de una cápsula de tejido fibroso. Aunque puede generarse tejido óseo especializado sobre la capa de tejido fibroso, dicha capa actúa como un eslabón débil entre el implante y el hueso que se haya podido formar posteriormente. La presencia de esta capa de tejido fibroso puede favorecer la aparición del infecciones o el aflojamiento del implante, situaciones cuya solución requiere de una nueva intervención quirúrgica para la revisión del implante. En este contexto, el desarrollo de biomateriales con la capacidad de establecer un contacto íntimo con el tejido óseo constituye un reto de la máxima importancia. Una estrategia para alcanzar este objetivo lo constituye la modificación del material uniendo a su superficie moléculas adecuadas mediante un enlace covalente. Dicho procedimiento debe promover la actividad de células especializadas sobre la superficie del material, al mismo tiempo que preserva las propiedades en volumen del mismo. La realización del procedimiento indicado requiere considerar tres pasos complementarios. En primer lugar, se tienen que generar grupos funcionales adecuados sobre la superficie del material. En segundo lugar, se debe emplear una química con agentes entrecruzantes apropiados para unir los grupos funcionales de la superficie del material con las biomoléculas diana y, en tercer lugar, deben seleccionarse unas biomoléculas diana que tengan la capacidad de inducir el efecto deseado en las células del organismo siendo, adicionalmente, compatibles con la química entrecruzante seleccionada. Por tanto, el objetivo de este trabajo es el desarrollo de un procedimiento robusto que permita la inmovilización covalente de diversas biomoléculas sobre la superficie de una aleación Ti-6Al-4V. Para este fin se utilizó una novedosa técnica que permite la deposición de grupos amino sobre la superficie de los sustratos de Ti-6Al-4V, denominada silanización por vapor activado (AVS, por su acrónimo en inglés). La variación de los parámetros de deposición en la técnica AVS permitió depositar diferentes láminas delgadas funcionalizadas sobre los sustratos de Ti-6Al-4V, estudiándose tanto la rugosidad superficial como la densidad de grupos amino superficiales de las láminas depositadas. Basándose en los resultados obtenidos se han seleccionado dos condiciones de funcionalización óptimas, procediéndose a una caracterización más exhaustiva de las mismas en términos de espesor, ángulo de contacto, respuesta celular y estabilidad de la lámina delgada bajo condiciones fisiológicas. Se seleccionaron cuatro biomoléculas diferentes con el objetivo de analizar su unión covalente a la superficie funcionalizada: colágeno de tipo I, albúmina, fibrinógeno y fibronectina. En una fase inicial, cada proteína se adsorbió sobre la superficie sin funcionalizar de la aleación Ti-6Al-4V, estudiándose la respuesta a dichas proteínas de células pre-osteoblásticas murinas (MC3T3-E1) y de células mesenquimales de médula ósea (BM-MSC), también de ratón. Estos estudios permitieron concluir que tanto la presencia del colágeno tipo I como de la fibronectina ejercía una respuesta positiva a la adhesión celular sobre la superficie del material. En experimentos independientes, se procedió a la inmovilización covalente a superficies funcionalizadas mediante AVS de las cuatro proteínas mencionadas anteriormente empleando como agentes entrecruzantes EDC/NHS. Se procedió a la caracterización de las proteínas inmovilizadas mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) y microscopía de fluorescencia. Además, se evaluó la estabilidad de las proteínas inmovilizadas mediante la exposición de las muestras a diferentes detergentes, encontrándose que las proteínas inmovilizadas covalentemente presentaban una mayor estabilidad comparadas con las proteínas simplemente adsorbidas sobre la superficie. Finalmente, considerando que tanto la presencia del colágeno tipo I como de la fibronectina adsorbidas había conducido a una mejora en la respuesta biológica de las células BM-MSC sobre las muestras de Ti-6Al-4V, ambas proteínas fueron seleccionadas para la caracterización biológica de las proteínas inmovilizadas covalentemente. La reacción de las células BM-MSC al colágeno tipo I y a la fibronectina inmovilizados se investigó mediante la realización de cultivos celulares. En particular, fue necesario desarrollar un protocolo de limpieza para eliminar el exceso de EDC/NHS debido a su posible efecto citotóxico sobre las células. En conclusión, se ha encontrado que la inmovilización covalente de colágeno tipo I o, alternativamente, de fibronectina conduce a una mejora en la adhesión de las células BM-MSC a la aleación Ti-6Al-4V. Este descubrimiento puede ser empleado para el desarrollo de biomateriales que tengan que estar en contacto íntimo con el hueso y que presenten una respuesta biológica mejorada con respecto a los materiales empleados para esta función en la actualidad. ---------ABSTRACT--------- Titanium and its alloys are among the most-frequently used biomaterials for the replacement of hard tissue. This choice is due to their good corrosion resistance, superior mechanical properties and excellent biocompatibility. The feature that separates titanium and titanium alloys from the rest of the metallic biomaterials, is their elastic modulus which is lower than that of the rest of the metallic biomaterials and closer to the elastic modulus of bone. These properties make titanium alloys the ultimate choice for fabrication of biomaterials for hard tissue replacement, particularly for load-bearing applications. However, a drawback in using titanium as bone implant is that it lacks the ability to establish a direct contact with the adjacent bone. More often, the implant is surrounded by a capsule of fibrous tissue. The specialized tissue is able to form on top of the fibrous tissue layer, but the fibrous tissue acts as a mechanically weak link between the implant and the newly formed bone. The presence of this fibrous tissue layer might cause infections or loosening of the implant and lead to the need for revision surgery. In this regard, development of biomaterials capable of establishing a close integration with bone tissue is of outmost importance. One strategy to address this problem is to modify the surface of the material by covalently binding proper biomolecules capable of promoting the activity of specialized bone cells on the surface, while preserving the excellent bulk properties of the material. To do so, it is necessary to consider three distinct but complementing steps. Firstly, the proper functional groups have to be generated on the surface of the substrate material. Secondly, a proper cross-linking chemistry must be employed in order to link the surface functional groups to the target biomolecule and thirdly, a biomolecule has to be chosen which should be able to induce the desired effect in the cells, while being compatible with the cross-linking chemistry. Thus, the objective of this work is to develop a robust method for the covalent immobilization of various biomolecules on the surface of Ti-6Al-4V alloy. In this regard, a novel technique for the deposition of amine functional groups on the Ti-6Al-4V substrates known as Activated Vapor Silanization (AVS) was used and studied. By varying the deposition parameters of AVS, different layers of amine functional groups were deposited on Ti-6Al-4V substrates and characterized in terms of roughness and surface amine concentration. Based on the findings, two optimal functionalization conditions were selected and further characterized in terms of layer thickness, contact angle, cell response and stability under physiological conditions. Four different target biomolecules were addressed in this work: Collagen type I, albumin, fibrinogen and fibronectin. Initially, each protein was physically adsorbed on the surface of the bare Ti-6Al-4V alloys and the response of mouse pre-osteoblasts (MC3T3-E1) and bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC) to the adsorption of these proteins was determined. It was concluded that collagen type I and fibronectin were able to positively influence the adhesion of BM-MSCs on the Ti-6Al-4V samples. On the other hand, all mentioned proteins were covalently immobilized on the surface of AVS-functionalized Ti-6Al-4V samples using EDC/NHS as cross-linker. The immobilized proteins were characterized by atomic force microscopy (AFM) and fluorescence microscopy. Additionally, the stability of the immobilized proteins was assessed by exposure to detergents and, as expected, it was found that the covalently immobilized proteins were more stable than the physically adsorbed ones. Finally, the reaction of BM-MSCs to the covalently immobilized collagen type I and fibronectin was investigated by performing cell cultures. In this regard, a cleaning protocol for removal of excess EDC/NHS as a possible cause of toxicity was also developed. Ultimately, it was concluded that the covalent immobilization of either collagen type I or fibronectin leads to an enhanced BM-MSC adhesion on Ti-6Al-4V. This finding may be employed for the development of bone-contacting biomaterials with enhanced biological properties.