Tesis:
Synthetic biology tools for the study of relevant factors in the control of transgene expression
- Autor: PÉREZ GONZÁLEZ, Ana
- Título: Synthetic biology tools for the study of relevant factors in the control of transgene expression
- Fecha: 2018
- Materia: Sin materia definida
- Escuela: E.T.S. DE INGENIEROS AGRONOMOS
- Departamentos: BIOTECNOLOGIA-BIOLOGIA VEGETAL
- Acceso electrónico: http://oa.upm.es/52923/
- Director/a 1º: CARO BERNAT, Elena
- Resumen: La biología sintética (SynBio) es una disciplina emergente que combina conceptos de los campos de la ingeniería y la biología con el objetivo de diseñar y construir nuevos sistemas biológicos artificiales con características útiles para aplicaciones concretas. El aumento de la población mundial, que se espera alcance los nueve mil millones en 2025, está llevando a los científicos a buscar métodos y tecnologías que puedan satisfacer las necesidades futuras de alimentos, combustibles y medicinas. En este contexto, la SynBio es una poderosa herramienta para el diseño y la generación de organismos con nuevas características genéticas y capacidades metabólicas que les permitan producir alimentos y compuestos de manera más eficiente. Aunque muchos proyectos de SynBio se encuentran ya en marcha y se espera que más les sigan en el futuro cercano, aún no se ha logrado controlar completamente la expresión de los transgenes, lo que implica un problema importante que debe ser resuelto. En esta tesis, hemos estudiado algunos factores relevantes que influyen en la regulación de la expresión de transgenes en dos organismos modelo, Saccharomyces cerevisiae y Arabidopsis thaliana. Hemos utilizado un enfoque que consiste en la aplicación de técnicas de clonaje modular para generar múltiples construcciones, lo que nos ha permitido cambiar una sola variable y analizar su efecto sobre la expresión, manteniendo constante el resto de la unidad transgénica. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo comúnmente utilizado para aplicaciones de biotecnología y biología sintética, ya que sirve como punto de partida para proyectos de ingeniería de eucariotas superiores que comparten muchas de sus características celulares y metabólicas. Hemos adaptado la técnica de clonaje modular GoldenBraid para la integración de unidades transcripcionales en el genoma de la levadura, y hemos generado un conjunto de herramientas que incluye librerías de promotores, señales de direccionamiento mitocondrial (MTSs), terminadores y casetes de resistencia. Esta herramienta nos ha permitido estudiar el funcionamiento de un conjunto de promotores y MTSs bajo estados metabólicos específicos, con el fin de comparar el comportamiento de las diferentes piezas bajo las mismas condiciones de cultivo y contexto genómico. Las plantas son fuente de muchos compuestos de utilidad (alimentos, piensos o fibras) y poseen una extraordinaria diversidad y plasticidad metabólica, propiedades que las hacen ideales para su utilización en proyectos de biología sintética. Sin embargo, en el campo de la biotecnología vegetal, aún existen importantes limitaciones a la hora de conseguir una expresión transgénica elevada y estable. Uno de los obstáculos a superar es el silenciamiento de transgenes que ocurre como consecuencia de la activación de los mecanismos de defensa de la planta los cuales han evolucionado para proteger el genoma del DNA extraño. En esta tesis, hemos utilizado Arabidopsis como organismo modelo para el estudio de dos aspectos que afectan a la expresión transgénica. Uno de ellos es el efecto posicional causado por el contexto genómico circundante de la región donde se inserta un transgén, y por lo cual se ha analizado el papel de los aislantes genéticos. El otro es el silenciamiento génico transcripcional y postranscripcional generado en respuesta a la presencia del transgén en sí mismo, por lo que nos hemos centrado en estudiar si hay elementos presentes en los terminadores y promotores que puedan desencadenar la respuesta de silenciamiento del transgén. ----------ABSTRACT---------- Synthetic biology (SynBio) is an emerging discipline that joins concepts from the engineering and the biological fields with the objective to design and construct new artificial biological systems with characteristics that are useful for particular applications. The increase of the world’s population, expected to reach nine billion by 2025, is leading scientists to look for methods and technologies that can supply the future requirements of food, fuels and medicines. In this context, SynBio is a powerful tool for engineering organisms and providing them with new genetic and metabolic capabilities in order to produce food more efficiently and compounds on demand. Although many SynBio projects have already been initiated and many more will follow in the near future, the fact is that the control of transgene expression is not yet completely under control and this entails an important problem that has to be solved. In this thesis, we have studied some relevant factors that influence transgene expression regulation in two model organisms, Saccharomyces cerevisiae and Arabidopsis thaliana. We have used an approach consisting on the application of modular cloning techniques to generate multiple constructs, what allowed us to change a single variable and analyse its effect on expression, keeping the rest of the transgene unit constant. Saccharomyces cerevisiae is a microorganism commonly used for biotechnological and synthetic biology applications, since it serves as a starting point for more complicated engineering projects in higher eukaryotes that share many of its cellular and metabolic characteristics. We have adapted the GoldenBraid modular cloning technique for the integration of transcriptional units into the yeast genome, and generated a toolkit that includes libraries of promoters, mitochondrial targeting signals (MTSs), terminators and resistance cassettes. This tool has allowed us to study the performance of a set of promoters and MTSs under specific metabolic states, in order to compare the behaviour of the different parts under the same culture conditions and genomic context. Plants are already used as sources of many useful compounds (food, feed or fibre) and have an extraordinary metabolic diversity and plasticity, properties that make them ideal for complex metabolic engineering projects. However, in plant biotechnology, scientists have to deal with important challenges to increase and stabilize transgene expression. One of the obstacles to overcome is the silencing of transgenes as a consequence of the activation of the plant’s defence mechanisms that have evolved to protect the genome against foreign DNA. In this thesis, we have used Arabidopsis as a model organism and studied two aspects affecting transgene expression. One of them is the positional effect caused by the surrounding genomic context where a transgene is inserted, for what the role of genetic insulators has been analysed. The other one is the transcriptional and posttranscriptional gene silencing generated in response to the presence of the transgene itself, where we have focused on studying if there are any features present in terminators and promoters that can trigger the transgene silencing response.